BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES Marçal Pastor-Anglada DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICA 10 de Febrero de 2005

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

QUIMIOTERAPIA. MECANISMOS DE ACCIÓN Mayoritarimente análogos de nucleósidos. Antimetabolitos Interferencia en la síntesis de nucleótidos. Acción en fase S. Incorporación a DNA y RNA. Reparación---Radiosensibilización Integridad mitocondrial Arresto en ciclo o muerte por apoptosis. A PESAR DE QUE EN LA ACTUALIDAD EL UNICO TRATAMIENTO POTENCIALMENTE CURATIVO DEL CANCER DE PANCREAS ES LA CIRUJIA, SOLO UN PORCENTAJE MUY BAJO DE PACIENTES SON SUSCEPTIBLES DE SER OPERADOS. POR TANTO, LA GRAN MAYORIA RECURREN A TRATAMIENTOS CON QUIMIOTERAPIA. EL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE ACCION DE ESTOS FÁRMACOS ES MUY IMPORTANTE PARA PODER DETERMINAR LAS VIAS POR LAS CUALES LOS TUMORES SE HACEN RESISTENTES AL TRATAMIETO. ASI, COMO HEMOS VISTO, LOS FÁRMACOS UTILIZADOS SON MAYORITARIAMENTE ANÁLOGOS DE NUCLEOSIDOS QUE INTERFIEREN EN LA SINTESIS DE NUCLEÓTIDOS. POR ELLO, ACTUAN MAYORITARIAMENTE EN LA FASE S DEL CICLO CELULAR. SE INCORPORAN AL DNA Y AL RNA Y AFECTAN A PROCESOS DE REPARACION. POR ELLO PUDEN LLEGAR A CAUSAR RADIOSENSIBILIZACION. ALGUNOS DE ELLOS TAMBIEN AFECTAN LA INTEGRIDAD DE LA MITOCONDRIA. FINALMENTE, CAUSAN UN ARRESTO EN EL CICLO CELULAR O BIEN LA MUERTE POR APOPTOSIS. ANTES DE EJERCER SU ACCIÓN EN EL INTERIOR DEBEN SER TRANSPORTADOS AL CITOPLASMA Y ESTE ES EL PRIMER PASO EN LA ACCIÓN DEL FÁRMACO. YA QUE LA MAYOR PARTE DE FÁRMACOS SON DE NATURALEZA HIDROFÍLICA, EL TRASPORTE SE LLEVA A CABO GRACIAS A LA ACCION DE PROTEINAS ESPECIFICAS DE MEMBRANA. Adaptado de Pastor-Anglada et al., Trends in Pharmacological Sciences 19:424.430, 1998

GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN H F N 2 GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN O H F N 2 dFdC Desfosforilada por la 5’-NT I Fosforilada por la dCK y TK2 O H F N 2 -P dFdCMP dCDA dCMPdA Quinasas EN LAS SIGUIENTES DIAPOSITIVAS SE MUESTRA EL MECANISMO DE ACCION DEL FARMACO GEMCITABINA USADO ACTUALMENTE EN EL TRATAMIENTO DEL CANCER DE PANCREAS. UNA VEZ EN EL INTERIOR CELULAR, LA GEMCITABINA ES FOSFORILADA POR LA ACCION DE LA DESOXICITIDINA KINASA Y EN MENOR GRADO POR LA TIMIDINA KINASA 2 PARA FORMAR EL MONOFOSFATO DE GEMCITABINA. ESTE, A SU VEZ, PUEDE SER DETOXIFICADO POR LA ACCION DE LA DESOXICITIDINA DESAMINASA Detoxificación a dFdUMP y dFdU O H F N 2 -PP dFdCDP Quinasas O H F N 2 -PPP dFdCTP

GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN H F N 2 GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN O H F N 2 dFdC Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA. Inhibición de la timidilato sintasa. Radiosensibilización O H F N 2 -P dFdCMP Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA. O H F N 2 -PP dFdCDP Inhibición de la ribonucleótido reductasa. Los diferentes metabolitos intermedios de la gemcitabina contribuyen a su acción con diferentes efectos. El nucleósido gemcitabina inhibe la citidina desaminasa y la dCDA, al igual que la forma monofosfato, de esta manera potenciando así su acción y aumentando la cantidad de fármaco activo en la célula. El nucleósido inhibe también en un 90% la timidilato sintasa, enzima clave en la producción del dTMP, deplecionando así los pools de este nucleótido. Junto con esta inhibición, la forma difosfato inhibe la ribonucleótido reductasa, enzima clave de la vía de salvamento del metabolismo de nucleótidos. Finalmente, la forma trifosfato se incorpora al RNA y al DNA inhibiendo la replicación de las cadenas mediante la adición de un nucleótido adicional, lo que se llama terminación enmascarada de la cadena. De esta manera se evita la reparación del DNA mediante la excisión de un par de bases. Los efectos de las tres formas fosfato contribuyen así a la acción radiosensibilizadora de la gemcitabina. dFdCTP O H F N 2 -PPP Incorporación a DNA y RNA

CAPECITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN H N NH NH2 O F CAPECITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN H N NH NH2 O F N4-pentyloxycarbamyl-5’-deoxy-5-fluorocytidine Capecitabina Carboxil esterasa H N NH NH2 O F 5’-deoxy-5-fluorocytidine 5’-DFC Citidina desaminasa Una nueva fluoropirimidina oral con acción citotóxica en gran cantidad de tumores sólidos es la capecitabina. La capecitabina consiste en una modificación del 5-fluorouracilo, la n4-pentiloxicarbamil-5-desoxi-5-fluorocitidina, que le permite ser absorbida por la mucosa intestinal. La carboxil esterasa, presente mayoritariamente en el hígado y células de hepatoma, la convierte en la 5-desoxifluorocitidina y en el hígado y algunos tumores, la citidina desaminasa la convierte en el 5-DFUR. El 5dfur, de manera específica en células tumorales es transformada en 5-FU por la acción de la timidina fosforilasa. El 5-FU es pues el metabolito activo de la capecitabina que actúa como ya he comentado inhibiendo la TS e incorporandose al RNA y DNA H N NH O F 5’-deoxy-5-fluorouridine 5’-DFUR Inhibición TS Incorporación a RNA y DNA DIANAS DEL 5-FU Timidina fosforilasa H N NH O F 5-fluorouracilo 5-FU

EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A FLUOROPIRIMIDINAS RESISTENCIA A GEMCITABINA. METABOLISMO dCK TK2 Disminución de la actividad causa resistencia Baja actividad aumenta la sensibilidad debido a que fosforila más eficientemente el nucleósido natural dCyd 5’-NT La sobreexpresión causa resistencia al desfosforilar los nucleótidos a nucleósidos RR Un aumento de la actividad o falta de inhibición de la ribonucleótido reductasa causa resistencia a gemcitabina. Los mecanismos de resistencia al tratamiento con análogos de nucleósidos pueden estar relacionados con el metabolismo intracelular del fármaco. Para la gemcitabina, se ha descrito un mecanismo de resistencia al tratamiento in vitro, causado por bajos niveles de actividad y de la proteína dCK. A su vez, una alta actividad TK2 junto con una baja actividad dCK se ha visto asociada a resistencia a gemcitabina como consecuencia de sus diferentes afinidades relativas por gemcitabina y el nucleósido natural. Tambien la actividad 5’-NT puede verse involucrada en resistencia a gemcitabina, ya que una alta actividad detoxificadora disminuye la concentración de las formas fosfato del análogo. Finalmente una aumento de la actividad RR o bien una incapacidad de inhibirla por parte de la forma difosfato de la gemcitabina es causa de resistencia parcial al no conseguir inhibir totalmente los pools de nucléotidos.

TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIA RESISTENCIA A GEMCITABINA: TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS?? TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS Metabolismo intracelular. Como ya hemos visto, la resistencia a los análogos puede estar causada por alteraciones en las enzimas que metabolizan el fármaco y en las dianas celulares de los diferentes metabolitos. Así mismo, la eficiencia de incorporacion a DNA y a RNA gracias a las afinidades de las respectivas polimerasas, así como diferentes proteínas de la maquinaria apoptótica pueden determinar la aparición de resistencia al tratamiento en células tumorales pancreáticas. Como se ha indicado, una parte muy importante de la activación del fármaco es el transporte de este al interior celular. El transporte podría jugar un papel muy importante en la acción del fármaco y podría ser causa de la aparición de resistencias al tratamiento con derivados de nucleósidos. DNA y RNA polimerasas. Mutaciones en el gen p53. Proteínas de la familia Bcl-2. Caspasa 8. Vía PI3’K.

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

Mecanismos de transporte de nucleósidos al interior de la célula ENT Equilibrative Nucleoside Transporter CNT Concentrative Nucleoside Transporter S Na IN OUT S S IN OUT TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER UP-HILL DOWN-HILL

ENTs (SLC29), transportadores de baja afinidad y amplia selectividad Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001 hENT family ei ENT2 es ENT1 Uridine CO2- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 NBTI NH3+ TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY INHIBITORS (IC 50 ) SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION hENT1 SLC29A1 456 50% NBTI 0.4nM Dip 5nM U 0.26mM A 0 .04mM Ubiquitous, plasma, perinuclear I 0.17mM C 0.58mM and mitochondrial membranes hENT2 SLC29A2 NBTI 2.8 m M Dip 356nM U 0.25mM A 0.14mM Ubiquitous, highly abundant I 0.05mM C 5.61mM in skeletal muscle Nuclebases (hypoxanthine)

CNTs (SLC28), transportadores de alta afinidad, relativamente específicos Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001 NH3+ CO2- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 hCNT family N CNT 1-3 Na Uridine INSISTIR EN LA CLÁSICA VISIÓN DE QUE TODOS PARECÍAN SER TRANSPORTADORES DE ADENOSINA. REMARCAR EN LA ALTA EXPRESIÓN DE HCNT2 EN HÍGADO Y POCA CARACTERIZACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN TISULAR DE HCNT3 A NIVEL PROTEICO PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY STOICHIOMETRY SUBSTRATES ( Km) TISSUE DISTRIBUTION hCNT1 SLC28A1 650 72% and 48% 1-2Na/1Nucleoside U 40-60 m M T 6 M Most epithelia, macrophages, (kidney, intestine) C 34 I n.t. hCNT2 SLC28A2 658 47% 1Na/1Nucleoside U 80 M I 4.5 M Epithelia (liver), macrophages,brain, ilots, B,T cells, brain,heart,skel.muscle A 8 M T n.t. hCNT3 SLC28A3 691 2Na/1Nucleoside U 22 M T 21 M Widely distributed, not solved yet at the protein level I 53 M A 15 M

LOS NUCLEÓSIDOS SON MOLÉCULAS CARAS Barrett and Grisham, 1995 Biochemistry Vias biosintéticas: LOS NUCLEÓSIDOS SON MOLÉCULAS CARAS Algunos tipos celulares, especialmente aquellos de alto recambio, dependen esencialmente de las vías de “recuperación” -ENTEROCITOS -CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER

Los transportadores de nucleósidos en la naturaleza Los CNTs humanos y de mamíferos tienen ortólogos en nemátodos, insectos, protozoos, levaduras, bacterias,.... La vía de recuperación está altamente conservada Role of nucleoside transporters SLC28 and SLC29 in cancer chemotherapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J., en Deoxynucleoside analogs in cancer therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc.Totowa, New Jersey, en prensa

Procesos celulares en los que los nucleós(t)idos están involucrados -Precursores de ácidos nucléicos (ARN y ADN) -Activadores en vías biosintéticas (p.e. UDP) -Unidades de transferencia de energía (ATP,GTP) -Coenzimas (NAD, FAD) -Moduladores de la fisiología celular (cAMP, ATP, Ado) La base de la quimioterapia radica en el aprovechamiento de las vías de recuperación de aquellas células que presentan elevados índices de proliferación

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

LA GEMCITABINE (GEMZAR), PERO NO LA FLUDARABINA, ES UN SUBSTRATO CAPTADO CON ALTA AFINIDAD APARENTE POR EL TRANSPORTADOR hCNT1 EJEMPLO DE SISTEMAS HETERÓLOGOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS PARA DEFINIR PERFILES FARMACOLÓGICOS Lostao, M.P., Mata, J.F., Larrayoz, I.M., Inzillo, S.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. FEBS Letters 481:137-140, 2000

K 0.5 (mM) % corriente uridina 0.5mM Vh=-50 mV K 0.5 (mM) % corriente uridina 0.5mM Uridine 37±7 (8) 100 (8) Cytidine 29±8 (6) 47±7 (6) Thymidine 26±7 (4) 109±19 (4) Gemcitabine 18±5 (8) 33±5 (8) 5’-DFUR 245±39 (7) 147±18 (7) ELECTROPHYSIOLOGY HAS BEEN PARTICULARLY HELPFUL IN DETERMINING INTERACTION CONSTANTS WITH NUCLEOSIDE DERIVATIVES USED IN ANTICANCER TREATMENT. HCNT1 IS THE “KEY” TARGET IN PYRIMIDINE-NUCLEOSIDE (PARTICULARLY FLUOROPYRIMIDINE-DERIVATIVES) UPTAKE PROCESSES. THESE DRUGS ARE CURRENTLY USED IN THE TREATMENT OF SOLID TUMORS. Larráyoz, I.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M., Lostao, M.P. Journal Biological Chemistry 279:8999-9007, 2004.

5’-desoxi-5-fluorocitidina 5’-desoxi-5-fluorouridina (5-DFUR) La capecitabina (Xeloda) es un profármaco oral de última generación utilizado en el tratamiento de tumores de colon y mama Carboxilesterasa Capecitabina 5’-desoxi-5-fluorocitidina HÍGADO HÍGADO - TUMORES? Citidina desaminasa 5’-desoxi-5-fluorouridina (5-DFUR) TImidina Fosforilasa TUMORES 5-fluorouracilo 5-DFUR, EL INTERMEDIARIO INMEDIATO DE 5-FU EN TUMORES, ES SUBSTRATO DEL TRANSPORTADOR CONCENTRATIVO DE ALTA AFINIDAD hCNT1 Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001

La expresión heteróloga de hCNT1 confiere sensibilidad a 5-DFUR, independientemente de las actividades equilibrativas endógenas. -dipyridamol CHO wt CHO-vector CHO-hCNT1 +dipyridamol Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001

CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. SENSIBILIDAD A GEMCITABINA EFECTO DE LA REINTRODUCCIÓN DE hCNT1 SOBRE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LA GEMCITABINA PC1 NP-9 HC1 TANTO EN UNA EXPOSICIÓN A GEMCITABINA COMO EN UN PROTOCOLO DE TRIPLE EXPOSICIÓN AL FÁRMACO, LA PRESENCIA DE hCNT1 SENSIBILIZÓ LAS CÉLULAS AL TRATAMIENTO CON EL FÁRMACO ENSAYO DE CITOTOXICIDAD DE GEMCITABINA EN LOS CLONES DE NP-9 72 H DESPUÉS DE 90 MINUTOS DE INCUBACIÓN AL FÁRMACO García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M. Clinical Cancer Research 9:5000-5008, 2003

IC50 (M) Km (M) Cytidine 4.5±0.2 3.1±0.7 Thymidine 12.55±1.93 ND AZT d4T 5-DFUR Cytidine ddC 3tC Gemcitabine IC50 (M) Km (M) RECENTLY WE HAVE FOUND OUT THAT, SURPRISINGLY, HCNT1 IS NOT A BROAD SELECTIVITY TRANSPORTER FOR PYRIMIDINE NUCLEOSIDE DERIVED DRUGS. THIS IS THE CASE FOR CURRENTLY USED ANTIVIRAL DRUGS REMARK THEN THE EASIEST COMPARISON AMONG THEM: 3’OH GROUP IS A COMMON DIFFERENCE AMONG THE TWO GROUPS OF NUCLEOSIDES. Cytidine 4.5±0.2 3.1±0.7 Thymidine 12.55±1.93 ND AZT 1004±150 963±135 d4T 4525±301 15600±4700 ddC 5730±222 NT 3tC >>20000 NT Gemcitabine ND 17±2 5-DFUR ND 209±51 Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004

Selectividad farmacológica de hCNT1 Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004 Cytidine 2’-deoxycytidine ddC

Perfiles farmacológicos preliminares de los transportadores hCNT y hENT   EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. Deoxynucleoside transporters in cancer therapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J. En Deoxynucleoside Analogs in Cancer Therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. En prensa Pastor-Anglada, M., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Bellosillo, B., Colomer, D., Gil, J. Leukemia 18:385-393, 2004

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR EL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR La expresión de estas proteínas es prácticamente ubicua o muy amplia Valdés, R., Ortega, M.A., Casado, F.J., Felipe, A., Gil, A., Sánchez-Pozo, A., Pastor-Anglada, M. Gastroenterology 119:1623-1630, 2000 CNT2 ENT1 ENT2 Las células de hepatoma presentan un perfil diferente de expresión de CNT y ENT. En general se ha descrito que los transportadores de nucleósidos son regulados por hormonas, nutrientes, nucleótidos de adenina y la activación de diversas vías intracelulares. Así mismo, la estimulación del crecimiento, el estado de desarrollo, el ciclo celular y la diferenciación celular se ha visto que afectan a la expresión de las diferentes actividades de transporte. En concreto, en el hígado adulto se co-expresan los transportadores CNT1 y CNT2 y muestran una alta actividad en contraposición a los transportadores equilibrativos ENT1 y ENT2. En los hepatocitos fetales, sin embargo, la situación es la contraria. La adición de hormonas tiroideas o glucocorticoides como la dexametasona, inducen la expresión de transportadores concentrativos y reducen el transporte equilibrativo. En otro modelo de proliferación hepática, la hepatectomía parcial, el hepatocito proliferante induce el transporte concentrativo, CNT1 y CNT2 sin variar la actividad de la isoforma ENT1. En la línea de hepatoma de rata FAO, se observa mayoritariamente la actividad ENT1 de transporte mientras que las actividades CNT1 y sobretodo CNT2 son prácticamente inexistentes. Esta desaparición de las isoformas sodio-dependientes de transporte en hepatoma de rata ha sido descrita por nuestro grupo en dos modelos distintos de hepatocarcinogénesis en la rata. del Santo, B., Valdés, R., Mata, J.F., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Hepatology 28:1504-1511, 1998 La diferenciación de hepatocitos fetales con dexametasona induce CNT2. Del Santo, B., Tarafa, G., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Journal of Hepatology 34:873-880, 2001

¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO? HEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTE Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M. Hepatology 32:239-246, 2000 H&E G-6Pasa TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER rCNT2 GSTp

SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA GÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCER MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40 Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M. Hepatology 32:239-246, 2000 H&E G-6Pasa TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER T-SV40 rCNT1

PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas) EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS.

CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES ANALISIS POR RT-PCR DE LA EXPRESIÓN DE hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2 y hCNT3 EN NPs LAS CUATRO LÍNEAS MUESTRAN ALTOS NIVELES DE mRNA DE hENT1 TAMBIEN SE DETECTA, AUNQUE EN MENOR MEDIDA EL mRNA DE hENT2 A PESAR DE LA AUSENCIA DE ACTIVIDAD CONCENTRATIVA DETECTADA EN LOS ENSAYOS DE TRANSPORTE TODAS LAS LÍNEAS NP EXPRESAN EL mRNA DE UNO O MÁS TRANSPORTADORES CONCENTRATIVOS. García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M. Clinical Cancer Research, 9:5000-5008, 2003

PANEL DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA TRANSPORTADORES NT M.Pastor Anglada, F.J.Casado Merediz, A.Felipe Campo, Method and in vitro kit for selecting a drug for chemotherapy WO 00/52477 Balagué Center, S.A. Países: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA ; JAPON ; CANADA ; UNIÓN EUROPEA ICC IHC western hCNT1a Extracellular No  IHC hCNT1b Intracellular hCNT2a hCNT2b WESTERN hCNT3 hENT1a hENT1b hENT2

Matrices de tejidos “Tissue array” Tongue Uterus Lung Kidney Liver Breast Analisis simultáneo de muchas muestras Cilindros adecuados para IHQ 2 mm................60 muestras 1.5 mm.......... 135 1 mm............. 200 Controles positivos y negativos internos Tinción homogénea Eficiente y rápido

A C G F E D B hCNT1 hENT1 hENT2 PATRONES DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS EN TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer 112:959-966, 2004 TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER

    SEMI-CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS NT EN TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer 112:959-966, 2004   Ovarian carcinomas Expression - + ++ hENT1 (n =90) 8 (8.8 %) 41 (45.6 %) hENT2 (n= 89) 14 (15.7 %) 54 (60.7 %) 21 (23.6 %) hCNT1 (n = 90) 30 (33.3 %) 45 (50.0 %) 15 (16.7 %) Endometrial carcinomas hENT1 (n = 80) 0 (0 %) 27 (33.8 %) 53 (66.2 %) hENT2 (n = 78) 47 (60.3 %) 31 (39.7 %) hCNT1 (n = 79) 12 (15.2 %) 60 (75.9 %) 7 (8.9 %) Uterine cervix carcinomas hENT1 (n = 117) 5 (4.2 %) 63 (53.9 %) 49 (41.9 %) hENT2 (n = 117) 2 (1.7 %) 55 (47.0 %) 60 (51.3 %) hCNT1 (n = 118) 46 (39.0 %) 33 (28.0 %) 39 (33.0 %)

 LA PÉRDIDA DE LA EXPRESIÓN DE hCNT1 SE ASOCIA CON SUBTIPOS HISTOLÓGICOS CONCRETOS DE TUMORES GINECOLÓGICOS   Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer 112:959-966, 2004 Expression of hCNT1 in ovarian carcinomas by hystologic type Hystologic type Expression   - + / ++ (%) Serous 6 25 80.6 Mucinous 5 9 64.3 Endometrioid 1 9 90.0 Clear cell 18 17 48.6 p = 0.016 TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER Expression of hCNT1 in uterine cervix carcinomas by hystologic type Hystologic type Expression   - + / ++ (%) Adenocarcinoma 35 29 45.3 Squamous cell 11 43 79.6 p < 0.001

PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas) EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS.

La sensibilidad ex-vivo a la fludarabina se correlaciona con el transporte del fármaco mediado por proteínas ENT, pero no guarda correlación con sus niveles de ARNm 2-fluoroadenine-9--D-arabinofuranoside p=0.029 r=0.488 p=0.006 r=0.591 TITULO Y PRESENTACION DEL TRABAJO TRANSPORTADORES DE NUCLEOSIDOS EXPRESION Y CANCER QUIMIOTERAPIA DEL CANCER Molina-Arcas, M., Bellosillo, B., Casado, F.J., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Fludarabine uptake mechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 101:2328-2334, 2003

ENT1 AND ENT2 PROTEIN EXPRESSION IN CLL PATIENTS Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005

LA PROTEINA hENT2 COMO BIOMARCADOR DE LA RESPUESTA A LA FLUDARABINA EN ENFERMOS DE LLC Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005 p= 0.1206 r = 0.379 p= 0.0258 r = 0.538 p= 0.0465 r = 0.475 p= 0.0060 r = 0.693

LA AUSENCIA DE hENT1 SE ASOCIA CON UNA MENOR SUPERVIVENCIA EN PACIENTES CON ADENOCARCINOMA PANCREÁTICO TRATADOS CON GEMCITABINA The absence of human equilibrative nucleoside transporter 1 is associated with reduced survival in patients with gemcitabine-treated pancreas adenocarcinoma Spratlin,J., Sangha, R., Glubrecht, D., Dabbagh, L., Young, J.D., Dumontet, C., Cass, C., Lai, R., Mackey, R.. Clinical Cancer Research 10:6956-6961, 2004

CONCLUSIONES 1.-EL PATRÓN DE EXPRESION DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS CNT Y ENT PUEDE TENER RELEVANCIA DIAGNÓSTICA, AUNQUE ANTICIPAMOS QUE SERÁ VARIABLE EN FUNCIÓN DEL TIPO DE TUMOR. 2.-ES FUNDAMENTAL ANALIZAR ESTOS PATRONES DE EXPRESIÓN EN TUMORES SÓLIDOS DE ENFERMOS QUE ESTÉN BAJO UNA TERAPIA CON DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS. 3.-LA POSIBILIDAD DE REGULAR FARMACOLÓGICAMENTE LA FUNCIÓN DE ESTAS PROTEÍNAS TAMBIEN SE APUNTA COMO UNA APLICACIÓN TERAPÉUTICA COADYUVANTE, AL PODER EVENTUALMENTE MODULAR LA BIOASEQUIBILIDAD DE FÁRMACOS. EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS.

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS EN CUANTO A LA TERAPIA DEL CANCER DE PÁNCREAS, EN LOS ULTIMOS AÑOS SE VENIA UTILIZADO COMO AGENTE QUIMIOTERAPICO EL ANTIMETABILITO DERIVADO DE BASE 5FLUOROURACIOLO. ESTE FÁRMACO SE CARACTERIZA POR LA INHIBICION DE LA TIMIDILATO SINTASA, DEPLECIONANDO ASI LOS POOLES INTRACELUALRES DE DESOXI TTP, E INHIBIENDO LA SINTESIS DE DNA Y RNA. ES UN POTENTE RADIOSENSIBILIZADOR PERO HA RESULTADO TENER POCO EFECTO SOBRE LA SUPERVIVENCIA GLOBAL DEL PACIENTE. MAS RECIENTEMENTE, SE UTILIZA EL ANÁLOGO FLUROADO DEL NUCLEÓSIDO CITIDINA, GEMCITABINA. ESTE FÁRMACO INHIBE TAMBIEN LA TIMIDILATO SINTASA Y LA RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA, UN ENZIMA CLAVE EN EL METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. SE INCORPORA AL DNA Y RNA INHIBIENDO LA ELONGACION DE LA CADENA. ES TAMBIEN UN BUEN RADIOSENSIBILIZADOR Y ES EL FÁRMACO DE ELECCION ACTUALMENTE. POR ULTIMO, Y COMO MUESTRA DE LAS DIVERSAS ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS EN DESARROLLO SE ENCUENTRA LA TERAPIA GENICA QUE CONSISTE EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS TUMORALES CON EL FIN DE CAUSAR EVITAR EL CRECIMIENTO TUMORAL Y CAUSAR LA MUERTE CELULAR. POR EJEMPLO, SE INTRODUCEN LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P53 Y P16 O BIEN DOMINANTES NEGATIVOS DEL ONCOGEN-RAS. ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

OBJETIVO Utilizar la técnica de microarrays de DNA para:  Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidos Efecto del 5’DFUR en células MCF7 (tumor de mama)  Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la acción de los análogos de nucleósidos Inhibición del transportador ENT1 con NBTI

Caracterización de la línea MCF7 Expresa los cinco transportadores de nucleósidos Presenta únicamente transporte equilibrativo, principalmente ENT1 5’DFUR es transportado mayoritariamente a través de ENT1 Citotoxicidad de 5’DFUR 90 minuto de tratamiento Medida por contaje celular +/- NBTI 100nM

CONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOS 5’-DFUR 250 M  NBTI  IC75 + NBTI  IC50  90 minutos de tratamiento  +/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min)  Efecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24h 8 condiciones experimentales control NBTI 100nM 4 y 24 horas postratamiento 5’-DFUR 250M 5’-DFUR 250M + NBTI 100nM arrays 2 experimentos independientes marcaje Cy3 y Cy5 32 arrays

EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 5’DFUR Y DE LA INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DEL TRANSPORTADOR hENT1 SOBRE EL CICLO CELULAR 4h 24h ctrl NBTI 5’DFUR 5’DFUR+NBTI G0/G1- 41% S- 36% G2- 23% G0/G1- 42% G2- 22% G0/G1- 51% S- 34% G2- 16% G0/G1- 52% S- 33% G2- 15% G0/G1- 54% S- 25% G2- 21% G0/G1- 50% S- 26% S- 38% G2- 19% G0/G1- 53% S- 24%

1- Obtención y amplificación de RNA 2- Síntesis y marcaje del cDNA 3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal) 4- Scanning 5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix 6- Obtención de datos ONCOCHIP-CNIO >27.000 SPOTS >12.000 GENES Descartar las columnas que no interesan. Nos quedamos (por ejemplo) con: Flag Bloque Columna Fila Nombre ID Media F635 Mediana B635 Media F532 Mediana B532 ANÁLISIS INFORMÁTICO Role of hENT1 in fluropyrimidine-induced gene expression in breast cancer cells. Molina-Arcas, M., Moreno-Bueno, G., Hernández, H.L., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M., submitted

RT-PCR semicuantitativa Diseñar primers de los genes a validar Análisis de homologia con isoformas de la misma familia - Control endógeno GAPDH (banda 175pb) Buscar para cada gen condiciones no saturantes 94ºC --- 5 min 94ºC --- 5 s 55ºC --- 30 s 72ºC --- 30 s 72ºC --- 7 min 30 ciclos 1,25 2,5 5 10 Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control endógeno (GAPDH) - + PLK2 RRM2B GAPDH Muy complicado amplificar el gen sin saturar la GAPDH Hacemos - cada gen por separado - cada condición por duplicado

RT-PCR semicuantitativa PLK2 TP53I3 RRM2B AQP3 TP53INP1 GAPDH CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N 4 horas 24 horas

Real-time PCR: FAS y p21 Real-time PCR  RNA Arrays  RNA amplificado Hemos perdido información al amplificar el RNA?

Immunocitoquímica: MDM2 4h 24h ctrl NBTI 5’DFUR 5’DFUR+NBTI

Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidos 90 minutos de tratamiento es un tiempo suficiente para ejercer una acción farmacológica El tratamiento induce parada de ciclo en fase S - El mayor efecto se produce a las 24 horas después de 90 minutos de tratamiento. La mayoría de genes que se inducen son dependientes de p53 El tratamiento con NBTI revierte el efecto sobre ciclo y la inducción de la mayoría de los genes En realidad estas técnicas tan sólo son generadoras de hipótesis Se demuestra imprescindible realizar análisis funcionales de las posibles dianas farmacológicas El microchip se transforma en un listado discreto de genes. En nuestro caso los validaremos tanto analizando el efecto de otros fármacos como determinando el papel de funciones transportadoras concretas sobre su función

Sonia Fernández Veledo REGULATION OF TRANSPORT SYSTEMS RESEARCH GROUP DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY Marçal Pastor-Anglada Javier Casado Elena Guillén-Gómez Sonia Fernández Veledo UNIVERSITY OF BARCELONA Sylvie Duflot José García-Manteiga Ivette Aymerich Míriam Molina REGULATION OF TRANSPORT SYSTEMS RESEARCH GROUP Pedro Cano-Soldado Isabel Huber Ruano FIS (Ministerio de Sanidad y Consumo), Plan Nacional en Biomedicina (Ministerio de Educación y Ciencia), Generalitat de Catalunya, Fundación Ramón Areces, FIPSE, Fundación “la Caixa”, Lilly, Roche Diagnostics, Balagué Center