Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II Biol 3019 Biología del Desarrollo Universidad de Puerto Rico-Aguadilla JA Cardé, PhD

Objetivos  Repasar los conceptos de equivalencia genómica y de expresión diferencial del genoma.  Repasar la anatomía de un gen y del mRNA  Promotores, enhancers,  TF y silencers  Explicar los mecanismos de transcripción diferencial  Discutir el procesamiento diferencial del mRNA  Resumir los mecanismos de controlde expresión genética: transcripcional, traduccional, pos- traduccional; y sus implicaciones en el desarrollo.

Mecanismos de Transcripción diferencial  TF: Ya se sabe quienes son, pero no se sabía su rol?  ChIP-Seq Technique:  Aislar y crosslink la cromatina  Cortar el DNA (sonicación/enzimas)  Incubar con AB vs la proteína de interés  Precipitar complejo AB-Prot-DNA  Separar el DNA, PCR y secuenciar

Mecanismos de Transcripción diferencial  ChIP-Seq, identifica dos tipos de promotores  High CpG content promoters  Default ON, DNA no metilado  activo; para inactivarlo metilar las histonas  En genes de control del desarrollo temprano  Regulan la síntesis de TF y otras proteínas reguladoras  Low CpG content promotors  proteínas características de etapas tardías, células maduras  Defaults OFF: DNA metilado  inactivo, hay que demetilar y esto permite modificar las histonas (H3K4me3) y la RNA pol II entra.

Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch  Histonas metiladas para?________________  … y el DNA? En las citosinas del promotor  5 Metilcitosina (5ta base) estabiliza nucleosomas previene transcripción  Presente en 5% de las C (seguidas por G) luego de la replicación  Regulación transcripcional en vertebrados  Metilación del DNA:  Bloquea la unión de TF a enhancers con C metilada  Facilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas, estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción (MeCP2)

Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch

Como comparan en (términos de metilación) el promotor de las globinas en RBC inmaduros vs RBC maduros durante el desarrollo?

Metilación: Patrones heredables: DNMT3  DNMT1 DNA CpG | DNMT3 (de novo) | DNMT1 (forever) Asignado : 3 estados de la cromatina: activa, reprimida o “poised” (pag 51).

RNA Procesamiento Diferencial:  La clave de la diferenciación celular es la síntesis de diferentes proteínas en diferentes tipos de células  En bacteria el control es: transcripcion, traduccion y postraduccion  En eucariota: uno mas; procesamiento y transporte  Splicing isoforms:  En humanos 90% de los genes lo usan  “Human Genes are multitaskers” – Christopher Burge  Genoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas GenesCellsProteins C elegans20,000959~20000 H sapiens20,000100,000 bil~100,000

Alternative Splicing Variants

Bcl-X S vs Bcl-X L : - large Bcl = inhibe apoptosis - short Bcl = induce apoptosis en tumores cual predomina? Spliceosome Factores de splicing - Expresados diferencial- mente -snRNA U1 y SF2 en 5’ -U2AF en 3’

RNAProcesamiento Diferencial: ER - Drosphila Dscam gene  La clave de la diferenciación celular es la síntesis de diferentes proteínas en diferentes tipos de células  Splicing isoforms:

Altenative Splicing: FGF IIIb vs IIIc -Ambos en entre ex 7 y 8 -En mesenq IIIC: mesodermo -En epitelio IIIB :ectodermo -Metilaciones marcan splicing

Splicing enhancers y recognition factors  Splicing enhancer (cis) sequences (SES)  Cerca de sitios de splicing  Promueven el ensamblaje del spliceosome  Recognition factors (trans) proteins  Reconocen las SES y reclutan el splicesoma  Polypirimidine track binding proteinas (PPT) reprimen la formacion del spliceosoma  Hay señales que sugieren que el contexto tambien es importante

Aplicación clínica Mutaciones en splicing sites:  La mayoria resultan en proteinas NO funcionales  Distrofina: mutación en un “splicing site” causa que se salte el exón  Myostatin gene: mutacion en el induce personas mas “fuertes”  Su proteina es un regulador negativo de division celular muscular  Hipertrofia muscular – como miostatina no esta, el musculo se sigue dividiendo hasta mas tarde: musculos mas grandes

Myostatin Knockout

Control: Nivel traduccional: longevidad diferencial  Longevidad diferencial del mRNA : media vida del mRNA  Mientras mas estable mas dura y mas copias de la proteína  Longitud del poli A, secuencias en el 3’UTR para mayor longevidad  Estabilización de ciertos mRNA en ciertos momentos en ciertas células  mRNA caseína : 1.1 hr en tejido mamario vs 28.5 hrs en lactancia (prolactina)

Control: Nivel traduccional: Inhibicion selectiva de mRNAs  Ovocito: fabrica y almacena los mRNAs que se usarán solamente luego de fecundación.  Se mantienen en estado durmiente hasta que llegue la señal: polaridad / iones  Ej de mRNAs en el huevo: histonas, actina/tubulina, ciclinas  Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox)  Regulación traduccional “negativa”: inhibidores

Control: Nivel traduccional: Inhibicion selectiva de mRNAs  5’Cap, 3’ Poly A ; si no estan no traduccion Circularización de mRNA - 5’ cerca de 3’ -eIF4E + -eiF4A (helic) -eiF4G (scaf) -poliABP - Maskin -CPEB (3’UTR) (uuuuau) -eIF4E -Fosforilacion de CP y Maskin activa

Control: Nivel traduccional - Tienen favoritismos los ribosomas? NO! - a favor: mRNAs de Euc son traducidos por ribosomas de Proc - sistema reticuloendotelial: traduccion por excelencia  SI: Selectividad ribosomal – Ribosomas tienen proteinas distintas dependiendo del tejido  Observación de un gen que causaba deformidad esqueleto axial  Por la traducción diferencial del gen : Rpf38  Proteina 38 del ribosoma en las somitas, controla expresion del Hox6  Deficiencia de Rpf38 causa deformidad vertebral  Rpf38  Hox6

Control: Nivel traduccional puede el RNA como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SI  microRNAs – eficiente y específico medio de regular la traduccion de un mRNA  Pequeños, complementarios a mRNA o parte de el  Anti sense RNA, primera vez en C elegans  Lin-4:  RNA 21nctds  silencia mRNA de lin 14 uniéndose a su 3’UTR, marcado para degradación  Lin14 usado en larva temprana, luego inactivado  miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan 50% de nuestros genes estructurales

-Conservado -El precursor tiene varios repeats, cada uno forma un loop -Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas -Estas lo hacen SS RNA -Empacado en RISC -Argonauta -Se unen al 3’UTR - Inhiben traducción - Perfect

Prim-Drosha  Prem- Dicer  microAgo

microRNAs  miR1- controla el balance entre crecimiento ventricular y diferenciacion  miR181 – esencial para la determinacion de celulas progenitoras en celulas B  miR430 – operacion limpieza de mRNAs maternales el ovocito una vez traducidos (zebra fish)  Fine tuning de Nodal: determinacion de ectodermo/endodermo  Son de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en el 5’  mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce?  Texel sheep: myostatin  Mutacion en el previene splicing  hipertrofia muscular, por deficiencia de miostatina  Otra forma: transicion A  G en 3’UTR, mir1 y mir 206, degradan el mRNA

Control de expresion de RNA: localización citoplásmica  Se regula el timing y la localizacion de la expresion  3’UTR – represion selectiva y localizacion selectiva  3 mecanismos de localizacion  Difusion y anclaje por proteinas activadoras (nanos)  Proteccion por localizacion (hsp83)  Libre difusion como nanos pero no es degradada en unas zonas especificas (polo posterior)

Transporte activo (mecanismo mas usado) Proteinas motoras ligan el 3’UTR y lo transportan Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid)