ICBM COMPUTATIONAL ANALYSIS OF CELL BEHAVIOUR IN DEVELOPING EMBRYOS |04|2007 Miguel Concha / Steffen Härtel Programa de Anatomía y Biología del Desarollo, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile

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Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Steffen Härtel | | Santiago | Chile

Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Huygens Professional Steffen Härtel | | Santiago | Chile

The observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function must be considered as a mini-sprectrofluorimeter. 1.You need to consider the Offset I(0) in order to calibrate your signal I(0)  0 ! 2.Never saturate the signal: I  I max (255 for 8 bit) ! I(0) > 0 I > I max N(PSF(x, y, z)  f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Microscopía | Diffraction limited microscopy Steffen Härtel | | Santiago | Chile

2| Microscopía confocal de fluorescencia: - Signal/Noise ratio - Nyquist / Sampling Theorem - Huygens Professional, Scripting Steffen Härtel | | Santiago | Chile

2. Microscopía | Noise Steffen Härtel | | Santiago | Chile Noise & Fluctuation Statistics Statistical Physics Stochastic Processes Probability Theory Information Theory Literature: eg. Noise Theory and Application to Physics: Philippe Réfrégier, Springer

PSF: Point Spread Function f: Object Function b: Offset Function I: Image Matrix N: Noise Function - Black Body Irrdiation (Poisson) - Detector Noise (Gauss) 2. Microscopía | Noise function N(PSF(x, y, z)  f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Steffen Härtel | | Santiago | Chile

2. Microscopía | Noise function N(PSF(x, y, z)  f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Steffen Härtel | | Santiago | Chile

2. Microscopía | PDF | Noise function N(PSF(x, y, z)  f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) GaussRayleighGamma ExponentialUniform Steffen Härtel | | Santiago | Chile

2. Microscopía | SNR Steffen Härtel | | Santiago | Chile

- Undersampling looses structures. - Oversampling waists memory/computation time. The ‘Nyquist /Shannon Theorem‘ or ‘Sampling Theorem‘ for the digital sampling of analogue signals suggests a Nyquist rate NR  2 ? ! Diffraction theory calculates lateral NR ~ 20 pixel/µm(~50 nm/pixel) !... laxial NR ~ (~150 nm/pixel) 2. Microscopía | Nyquist /Shannon / Sampling Theorem Steffen Härtel | | Santiago | Chile

2. Microscopía | Backprojected Pinhole Radius Pinhole radius [nm]: Huygens works with the backprojected pinhole radius (r b ): r phys : physicel pinhole diameter (LSM image information) m obj : objective magnification factor (10, 20, 40, 63 or 100X) m sys : fixed internal magnification.) NA : numerical aperture N AiryDisc : units of the airy disc r b = r phys / (m obj * m sys ) r b = 0.61 * * N AiryDisc / NA Steffen Härtel | | Santiago | Chile

The observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function (PSF) must be considered as a mini-sprectrofluorimeter: 1.You need to consider the Offset I(0) in order to calibrate your signal I(0)  0 ! 2.Never saturate the signal: I  I max (255 for 8 bit) ! I(0) > 0 I > I max Steffen Härtel | | Santiago | Chile Parameters for optimal image adquisition

From the Nyquist Theorem: The sampling frequency (or sampling distance) is a function of the observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function (PSF): 3.You need to consider sampling distances in  x and  y  50 nm and … 4.  z  nm for later deconvolution.  xy  50 nm Steffen Härtel | | Santiago | Chile Parameters for optimal image adquisition

PSF:  xy ~ 500 nm |  z ~ 1500 nm N(PSF(x, y, z)  f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Microscopía | Diffraction limited microscopy Steffen Härtel | | Santiago | Chile Z X Y X

H (x i,y j,r): X -> Y -> H (x i,y j,r) · I(x,y) Mean: Simplest Low Pass Simplest High Pass H =1/9 · H = Steffen Härtel | | Santiago | Chile Microscopía | Diffraction limited microscopy

H (x i,y j,r): X -> Y -> Steffen Härtel | | Santiago | Chile Microscopía | Diffraction limited microscopy Z X Y X

2. Basics of Fluorescence | Jablonski Diagram /  E,  t Intercombinación s s Transiciones: con radiación Niveles: vibracionales sin radiación | -> calor electrónicos -> transferencia de energía -> radicales s Fluorescencia s Fosforescencia s Absorción s Conversión interna Steffen Härtel | | Santiago | Chile

PSF: Point Spread Function f: Object Function b: Offset Function I: Image Matrix N: Noise Function Deconvolución es un problema inverso. Pero, la matrix I no tiene la información suficiente para determinar f en forma no ambigua. - Filtros inversos directos:... no consideran N ! - Filtro de Wiener (lineal, ruido tipo Gauss):... reducen, pero no eliminan N ! - Filtros Iterativos (Tikhonov-Miller, Carrington) - Algoritmo de Richardson-Lucy (Poisson):... finds Maximum Likelihood Solution ! 3. Microscopía | Deconvolución N(PSF(x, y, z)  f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Steffen Härtel | | Santiago | Chile Maximum Likelihood Solution (PhD-thesis, van Kempen, 1999)

Recipies for deconvolution:

Acceder a uno de los servidores SCIAN ingresando la contraseña correspondiente

En el escritorio, seleccionar el ícono del programa Huygens Professional

Seleccionar “O” en el cuadro de la imagen

En el menú File, seleccionar “Open”

Seleccionar el archivo a deconvolucionar

Una vez abierta la imagen, seleccionar “ O” en el cuadro de la imagen

Abrir la pestaña “Parameters”

Revisar y aceptar los parámetros utilizados en el experimento

Para setear los parámetros de deconvolución, abrir la ficha Classic MLE

Setear los parámetros de deconvolución e iniciar el proceso

Al finalizar es necesario guardar los datos deconvolucionados

Para guardar, seleccionar en el menú File las opciones “save as” y “tiff”