Erradicación de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1 Erradicación de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 con un prototipo de microondas sombra

Erradicación de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 con un prototipo de microondas I.- Justificación II.- Antecedentes III.- Objetivos IV.- Material y métodos V.- Resultados y discusión VI.- Conclusiones

I.- Justificación Índice

Enfermedad muy destructiva Reducción de la producción Fusariosis Vascular del melón Enfermedad muy destructiva Rápida propagación Reducción de la producción hasta en un 90% Índice Fuente: Soriano Martín, M. L., et al. 2001

Dificultad de control de Fusarium oxysporum f. sp. melonis Estructuras de resistencia muy persistentes Métodos de control en campo costosos y difíciles de manejar Mejor método de lucha Prevención del establecimiento del patógeno en el terreno de cultivo Índice

Zonas de mayor producción de melón (Castilla la Mancha) Implantación del cultivo mediante plántulas producidas en semilleros industriales Reutilización de bandejas de propagación Fuente: Conic System S. L., 2004 Fuente: Conic System S. L., 2004 Fuente: Páginas Agrarias de Ruralnet, 2004 Índice

Esterilización muy complicada Reutilización de bandejas de propagación Principal fuente de dispersión de la enfermedad Fuente: Conic System S. L., 2004 Naturaleza del material (Poliestireno Expandido) Problemas de fitotoxicidad y manejo con los desinfestantes químicos (Formol e Hipoclorito de Sodio) Lentitud de los hornos convencionales de desinfestación Esterilización muy complicada Índice

Energía microondas Grandes posibilidades de aplicación Desinfestación de bandejas de propagación Material vegetal exento del patógeno Grandes posibilidades de aplicación Control de la Fusariosis antes de su establecimiento en el campo Índice

II.- Antecedentes Índice

Hortaliza muy cultivada Familia: Cucurbitaceae Fruto muy demandado El melón Fuente: Namesny, A., 1997 Familia: Cucurbitaceae Especie Cucumis melo L. Fuente: MELYSOL, 2004 (melysol.com) Fuente: Zapata, M. et al., 1989 Índice

España produce alrededor del 5% del melón mundial China, Turquía, EE.UU., España e Irán España produce alrededor del 5% del melón mundial y exporta casi la quinta parte Cerca del 60% de la producción mundial de melón El melón en el mundo. Serie histórica de los principales países productores en los últimos años. (FAOSTAT, marzo de 2004). Índice

España produce prácticamente la mitad España, Italia, Francia, Grecia y Portugal España produce prácticamente la mitad del total en la UE y exporta casi el 80% Principales países productores de melón en la UE El melón en La Unión Europea. Serie histórica de la producción obtenida en los principales países productores de los últimos años. (EUROSTAT, 2004). Índice

Castilla-La Mancha produce el 34% del total español, Castilla-La Mancha, Andalucía, Murcia, Extremadura y Valencia Castilla-La Mancha produce el 34% del total español, destacando Ciudad Real, con el 28,6% Principales regiones productoras de melón en España El melón en España. Serie histórica de producción en las CC.AA. más representativas de este cultivo. (MAPA, 2004). Índice

Fusariosis Vascular del melón Sintomatología Amarilleamiento (Yellows) Marchitamiento (Wilts) Las hojas amarillean progresivamente de forma acrópeta Marchitamiento súbito de la planta desde la base hacia el ápice Índice

Fusariosis Vascular del melón Agente causal Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. melonis (Snayder y Hansen) Patógeno específico del melón Índice

Fusariosis Vascular del melón Control de la enfermedad Métodos culturales Métodos biológicos Métodos químicos Métodos físicos Índice

Tratamiento físico de Fusarium oxysporum f. sp. melonis Trabajos previos aplicando calor y energía microondas Reducción de la viabilidad del inóculo Reducción de la patogenicidad (incidencia y severidad de la enfermedad) Erradicación del patógeno Índice

III.- Objetivos Índice

Objetivos 1.- Obtención de la potencia calorífica real del prototipo de horno microondas utilizado en este trabajo 2.- Estudio de la influencia que producen las radiaciones del prototipo de microondas sobre la suspensión de inóculo de Fom raza 1.2 tanto en la viabilidad de conidias como en la patogenicidad del inóculo sobre plántulas de melón Amarillo Canario. Obtener datos de energías aplicadas con los diferentes tiempos de exposición a las microondas 3.- Estudio de la influencia que producen las radiaciones del prototipo de horno microondas utilizado sobre la viabilidad del inóculo en un substrato infestado con Fom raza 1.2 Índice

IV.- Material y métodos Índice

Material y métodos Índice Obtención de la potencia calorífica real de un horno microondas comercial y del prototipo de horno microondas utilizado en este trabajo Influencia del tratamiento con microondas sobre la viabilidad de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en suspensión acuosa Influencia del tratamiento con microondas sobre la viabilidad de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en un substrato artificialmente infestado Influencia del tratamiento con microondas sobre la patogenicidad de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en plántulas de melón Amarillo Canario Índice

y del prototipo de horno microondas utilizado en este trabajo Obtención de la potencia calorífica real de un horno microondas comercial y del prototipo de horno microondas utilizado en este trabajo Horno microondas prototipo Determinación de la potencia calorífica Resultados Índice

Horno microondas prototipo Diseñado y fabricado por las Cátedras de Motores y Fitopatología de la EUITA de Ciudad Real - 4 aberturas de salida de las microondas situadas dos a dos en caras opuestas de la cavidad interior - Volumen de la cavidad: 122,3 litros (72,5 cm x 67,5 cm x 25 cm) - Capaz de contener 3 bandejas de propagación - Dos puertas (frontal y trasera) - Apertura y cierre accionado mediante sistema de transmisión hidrostática - Conformación en chapa galvanizada de 2 y 3 mm - Unión mediante remaches de aluminio - Potencia de salida teórica: 4000 W - Alimentación: 220 V CA - Frecuencia de microondas: 2,45 Ghz - 4 magnetrones (1000 W cada uno) - Accionamiento manual Índice

Determinación de la potencia calorífica Recipientes de Poliestireno Expandido Volumen fijo de agua (800 ml) Irradiación con microondas durante 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360 y 420 segundos, hasta temperatura próxima a ebullición Medida de la temperatura antes y después de la irradiación Índice

Determinación de la potencia calorífica Recipiente centrado en el interior del horno - Un ensayo con un solo magnetrón (1000 W) - Un ensayo con dos magnetrones (2000 W) - Un ensayo con tres magnetrones (3000 W) - Un ensayo con cuatro magnetrones (4000 W) Índice

Energía (Jul) = m · Ce / 0,24 · ΔT Determinación de la potencia calorífica ΔT = Tf - Ti Ce = 1 Cal/grºC m = 800 gr 1 Jul = 0,24 Cal Energía (Jul) = m · Ce / 0,24 · ΔT Potencia real (W) = energía / tiempo de exposición Índice

Resultados Potencia media obtenida al someter 800 ml de agua a la radiación microondas durante distintos tiempos utilizando tanto el horno microondas comercial marca Daewoo, modelo KOC-970T, como el prototipo de horno microondas conectando de 1 a 4 magnetrones. Índice

de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en suspensión acuosa Influencia del tratamiento con microondas sobre la viabilidad de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en suspensión acuosa Incremento del inóculo Tratamiento térmico con microondas Viabilidad del inóculo Resultados Índice

Incremento del inóculo Repicado y cultivo de Fom en PDA Repicado y cultivo de Fom en CPD Filtrado de la suspensión líquida del hongo Cuantificación de la densidad del inóculo Ajuste de la concentración del inóculo M.liq. Subs. Patog.

Repicado y cultivo de Fom en PDA Explante de Fom raza 1.2 (raza más frecuente en Ciudad Real), aislado CR-6801 Fuente: Soriano Martín, M. L., et al. 2001 Placas de petri con PDA Incubación en estufa (25-27 ºC) durante 10 días Conservación en frigorífico Repicado en medio líquido (CPD) Índice

Repicado y cultivo de Fom en CPD 5 explantes de Fom raza 1.2 (raza más frecuente en Ciudad Real), aislado CR-6801 Fuente: Soriano Martín, M. L., et al. 2001 Matraces con 150 ml de CPD Incubación en cámara de ambiente controlado (16h/día de fotoperíodo, 27 ± 3 ºC, 70 ± 20% HR) durante 6 días Agitador orbital (120 rpm) Índice

Filtrado de la suspensión líquida del hongo Filtrado a través de dos Transcurridos 6 días de incubación en CPD Filtrado a través de dos gasas estériles Índice

Cuantificación de la densidad del inóculo Dilución a la décima parte de la suspensión filtrada Conteo de conidias mediante un hematocitómetro colocado en un microscopio C = Conidias / ml Índice

Ajuste de la concentración del inóculo Concentración deseada: 5∙106 conidias/ml V ∙ C = V’ ∙ C’ (V: volumen, C: concentrac.) Adición del volumen resultante de agua destilada estéril Índice

Tratamiento térmico con microondas 6 tubos de ensayo 10 ml de inóculo (5∙106 conidias/ml) por tubo Colocados equidistantes en el interior del prototipo M.liq. Patog.

Viabilidad del inóculo Método de las diluciones En cada uno de los viales se diluye el inóculo diez veces Índice

Viabilidad del inóculo Cultivo de las diluciones Diluciones 10-2 y 10-4 de cada tubo 100 μl Placas de petri con Agar-Jugo V6 Incubación en oscuridad a 25-27 ºC Índice

Viabilidad del inóculo Viabilidad expresada en UFC/ml ó UFC/gr Conteo de UFC 3er y 6º día de incubación Incontable si UFC > 300 Viabilidad expresada en UFC/ml ó UFC/gr M.liq. Subst.

Resultados Índice Tiempo (energía) Media de UFC/ml (1) Dilución 10-2 Número medio de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml) que se han desarrollado después de irradiar con microondas 10 ml de suspensiones acuosas (6 tubos de 10 ml cada uno) de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 (de concentración 5×106 conidias/ml) durante distintos tiempos (niveles de energía). Tiempo (energía) Media de UFC/ml (1) Dilución 10-2 Dilución 10-4 0 seg (0 jul) Inc. (2) 126,67×104 a 5 seg (5879,6 jul) Inc. 111,67×104 a 10 seg (11759,3 jul) 493,33×102 a 6,67×104 b 15 seg (17638,9 jul) 33,33×102 b 0,00 20 seg (23518,5 jul) 30,00×102 b 25 seg (29398,1 jul) 1,67×102 b 30 seg (35277,8 jul) (1) Valores en columnas seguidos de letras diferentes indican diferencias significativas al nivel 95% (p ≤ 0,05). (2) inc. = número incontable de UFC (más de 300 colonias). Índice

de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en un substrato Influencia del tratamiento con microondas sobre la viabilidad de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en un substrato artificialmente infestado Incremento del inóculo Infestación del substrato y tratamiento térmico con microondas Viabilidad del inóculo Resultados Índice

Infestación del substrato y tratamiento térmico con microondas Llenado de las bandejas con substrato estéril Infestación de 10 alvéolos con 3 ml de inóculo Los alvéolos siempre son los mismos Irradiación Colocación centrada de la bandeja en el interior del prototipo Índice

Viabilidad del inóculo Método de las diluciones En los tubos de ensayo y cada uno de los viales se diluye el inóculo diez veces Cultivo de las diluciones Conteo de UFC Índice

Resultados Índice Tiempo (energía) UFC/g (1) (2) Dilución 10-2 Número medio de Unidades Formadoras de Colonias por gramo de substrato (UFC/g) que se han desarrollado después de irradiar, con diferentes cantidades de energía, substrato infestado con 3 ml de suspensión de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 de concentración 5×106 conidias/ml. Tiempo (energía) UFC/g (1) (2) Dilución 10-2 Dilución 10-4 0 seg (0 jul) Inc.(3) 6,70×104 a 20 seg (23518,5 jul) Inc. 6,30×104 ab 40 seg (47037,0 jul) 4,20×104 ab 60 seg (70555,6 jul) 4,00×104 b 80 seg (94074,1 jul) 64,40×102 a 0,70×104 c 100 seg (117592,6 jul) 39,80×102 a 0,60×104 c 120 seg (141111,1 jul) 0,00 (1) Cada valor es la media de diez repeticiones. (2) Valores en columnas seguidos de letras diferentes indican diferencias significativas al nivel 95% (p ≤ 0,05). (3) inc. = número incontable de UFC (más de 300 colonias). Índice

Influencia del tratamiento con microondas sobre patogenicidad de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en plántulas de melón Amarillo Canario Preparación de las macetas para las plántulas Germinación de las semillas Siembra de las semillas Incremento del inóculo Tratamiento térmico con microondas Inoculación de plántulas Evaluación de la incidencia y severidad de la enfermedad Resultados Índice

Preparación de las macetas para las plántulas Índice

Germinación de las semillas de melón Amarillo Canario Se ha utilizado melón Amarillo Canario por ser sensible a las cuatro razas de Fom (0, 1, 2 y 1.2) Se mantienen en la cámara de ambiente controlado durante 5 días Índice

Siembra de las semillas En vasos con substrato estéril 50 vasos por bandeja Riego cada 48 horas 13 días en cámara de ambiente controlado 1ª hoja verdadera Índice

Inoculación de plántulas 40 plántulas por tratamiento del inóculo (4 repeticiones) 40 plántulas testigo (inóculo sin tratar) 40 plántulas sin inocular (agua destilada estéril) Se mantienen las raíces sumergidas en el inóculo durante 2 minutos En la cámara de ambiente controlado durante 22 días Riego cada 48 horas Índice

Evaluación de la incidencia y severidad de la enfermedad Cada 48 horas se evalúan los síntomas de severidad de Fusariosis Índice de severidad (%) Curvas de progreso de la enfermedad Índice

Resultados Curvas de progreso de la Fusariosis Vascular en plántulas de melón Amarillo Canario inoculadas con Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 irradiado con microondas durante distintos tiempos (niveles de energía). Índice

Resultados Media del Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (ABCPE) Fusariosis Vascular en plántulas de melón Amarillo Canario, inoculadas con Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 irradiado con microondas durante distintos tiempos (niveles de energía). Tiempo de exposición a las microondas y energía aplicada ABCPE (unidades2) (1) (2) 0 seg (0 jul) 1465,00 a 5 seg (5879,6 jul) 1426,25 a 10 seg (11759,3 jul) 1261,25 b 15 seg (17638,9 jul) 262,50 c 20 seg (23518,5 jul) 77,50 d 25 seg (29398,1 jul) 15,63 d 30 seg (35277,8 jul) 0,00 Testigo (control -) (1) Cada valor es la media de 4 repeticiones. (2) Valores en columnas seguidos de letras diferentes indican diferencias significativas al nivel 95% (p ≤ 0,05). Índice

VI.- Conclusiones Índice

Conclusiones El prototipo de horno microondas desarrolla, a pleno rendimiento, una potencia calorífica real que es un 45,1% superior a la producida por un microondas comercial. Las UFC se reducen, y por ello la viabilidad del inóculo, a medida que aumenta la energía que se aplica a éste. Se ha conseguido la erradicación del patógeno, tanto en suspensiones acuosas como en substrato al alcanzar las energías de 35.277,8 y 141.111,1 julios respectivamente. Determinándose que cuando se aplican 63,18 julios/gramo de substrato se erradica el patógeno. Cuanto mayor es la energía aplicada mayor es el retraso en la aparición de la enfermedad y mayor es la disminución de los índices de severidad. Este sistema de microondas resulta una técnica carente de riesgos y capaz de incorporarse en la cadena de siembra automática de plántulas de melón para erradicar eficazmente el patógeno en las bandejas de propagación antes de su siembra. Se deduce la posibilidad de aplicar este mismo sistema a todo un conjunto de cultivos producidos industrialmente por el mismo método y que son atacados por patógenos sensibles a la radiación microondas. Índice

Trabajo pendiente de publicación Artículos publicados Soriano Martín, M. L., Porras Piedra, A., Perez Bencecry, C., Martín Sánchez, O., Porras Soriano, A. y Martín Sánchez, D., “Eliminación con microondas de la Fusariosis del melón durante la propagación comercial de plántulas”, revista Phytoma-España. Soriano Martín, M. L., Porras Piedra, A., Martín Sánchez, O., Porras Soriano, A., Martín Sánchez, D. y Aragón, L. N., “Aplicación de microondas para la erradicación de la Fusariosis del melón”, revista Agricultura. Trabajo pendiente de publicación Actualmente, se encuentra pendiente de publicación un trabajo que ha sido enviado a la revista Spanish Journal of Agricultural Research

Gracias por su atención