Tecnologías en Biología Molecular y DNA Recombinante 7.1 Aislamiento de DNA 7.2 Digestión de DNA con enzimas de restricción 7.3 Electroforesis en geles de agarosa y mapas de restricción Olga Rosario Meraz Z. Flores 199375

Resultados de Aprendizaje Reconocer los fundamentos químicos para el aislamiento del DNA de organismos. Conocer las características y funciones de los plásmidos bacterianos. Explicar el procedimiento para el aislamiento de plásmidos y su cuantificación.

Reconocer las propiedades de las enzimas de restricción. Explicar los procedimientos para la elaboración de mapas de restricción de genes y genomas así como la importancia de este análisis para la caracterización de DNA. Reconocer los fundamentos y procedimientos de la electroforesis para la separación de fragmentos de DNA usando geles de agarosa y la importancia de éste análisis para la caracterización de DNA.

Errores más frecuentes No reconocer la ubicación del DNA así como las técnicas utilizadas para extraer tanto DNA genómico como plasmídico. No comprender la importancia del plásmido en la biología molecular. Confundirse con los tipos de enzimas de restricción que hay, así como el tipo de corte que generarán. No entender la función del mapa de restricción ni su elaboración. No saber la carga que presenta el DNA.

Introducción

Extracción de DNA Lisis de la célula Separación de fragmentos proteicos y fragmentos de RNA. Concentración del DNA

Lisis celular PROCARIOTE EUCARIOTE Detergentes NaOH Lisozima

Eliminación de proteínas y RNA Mediante el uso de Fenol/Cloroformo se separan los ácidos nucléicos de los fragmentos de proteínas. Los ácidos nucléicos quedaran en la fase acuosa y las proteínas desnaturalizadas quedaran en la fase orgánica.

Concentración del DNA Recuperación en solución tampón de nuestro producto de extracción relativamente limpio de compuestos celulares. Generalmente mediante el uso de Etanol a -20° C.

Plásmidos (bacterias)

Función del plásmido Replicación del DNA recombinante dentro de las células huésped Secuenciación del fragmento de interés (DNA externo) Fabricar librerías de cDNA. Expresar el gen clonado

Aislamiento del plásmido Lisis de pared y membrana bacteriana Separación de material DNA no plasmídico, proteínas y RNA. Concentración de DNA plasmídico. SDS NaOH Lisozima proteínas genómico plasmídico SDS Proteinasas RNasas Fenol RNA Etanol Isopropanol

Cuantificación La absorción de UV por el DNA es una característica  de ésta molécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración.

Enzimas de restricción

Tipos de enzimas Tipo I Tipo II Tipo III Cortan DNA bicatenario fuera de sus sitios de reconocimiento específicos. Tipo I Tipo II Tipo III Reconocen secuencias dentro del sitio de restricción. Específicos

Nomenclatura de Enzimas de Restricción E co R I Escherichia coli Ry13 genero especie cepa 1er enzima de restricción obtenida de E.coli

Tipo de corte de la enzima

Metilación La metilación en el DNA confiera a la bacteria evitar los cortes con las enzimas generadas por la misma.

FRAGMENTOS CORTADOS POR UNA ENZIMA 5´ AGGTCTGACAACCGGTGACCCTGACTAGAACTTAACTGCGGCCTGATCT 3´ TCCAGACTGTTGGCCACTGGGACTGATCTTGAATTGACGCCGGACTAGA TCCAGACTGT TGGCCA CTGG GAC TGATCTTG AATTGACGCCGGACTAGA AGGTCTGACA ACCGGT GACC CTG ACTAGAAC TTAACTGCGGCCTGATCT 1 2 3 4 5 6 6 1 5 2 3 4

Funciones de Enzimas de Restricción en Biología Molecular Fragmentar el DNA para separación por electroforesis. Mapas de restricción. Clonación.

Fundamentos de la electroforesis Técnica utilizada para separar las moléculas de DNA lineales por tamaño. Mediante corriente eléctrica se harán migrar los fragmentos de DNA por afinidad hacia el ánodo. Y según su tamaño se desplazarán por un material poroso como la gelatina.

Preparación: Agarosa (%) Buffer TAE o TBE Colorante (Bromuro de Etidio) Se prepara la muestra de DNA con un Buffer de carga (Azul de Bromofenol) La cámara de electroforesis Debe llenarse con Buffer (TAE o TBE) Recordar que el DNA tiene carga negativa por lo que migrará de negativo a positivo Los pozos están cubiertos por buffer

Importancia de este análisis Separación de los fragmentos del DNA para procedimientos posteriores Calidad del DNA. Análisis de secuenciación Número y tamaño de fragmentos de DNA (mapas de restricción, genotipificación).

MAPAS DE RESTRICCIÓN GENETICO Qué es un mapa de restricción? Cómo se elabora un mapa genético de restricción? La importancia de este análisis para la caracterización de DNA.

Mapa de Restricción Mapa que nos permite ubicar los sitios específicos de corte de ciertas enzimas en una secuencia de DNA. Es información en físico de pequeñas secuencias de DNA.

Cómo se elabora

Importancia de este análisis para la caracterización de DNA Establecer las bases teóricas en cuanto a la estructura del DNA de manera general introduciendo puntos de referencia en sitios de reconocimiento específicos para las enzimas de restricción. EJEMPLO: Caracterización de genomas pequeños principalmente. E.coli, Saccharomyces cereviceae

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Figure 7-2. Plasmid DNA replication Figure 7-2. Plasmid DNA replication. The parental strands are shown in blue, and newly synthesized daughter strands are shown in red. The short segments represent the A·T and G·C base pairs connecting the complementary strands. Once DNA replication is initiated at the origin (ORI), it continues in both directions around the circular molecule until the advancing growing forks merge and two daughter molecules are produced. The origin is the only specific nucleotide sequence required for replication of the entire circular DNA molecule.

VECTORES FORMA DEL VECTOR HUÉSPED TAMAÑO DEL INSERTO UBICACIÓN PLÁSMIDO dsDNA circular E.coli De 0.1 a 10 kb Genoteca de cDNA sub-clonación. BACTERIÓFAGO λ Virus, dsDNA lineal De 10 a 20 kb Genoteca genómica de cDNA. CÓSMIDO De 40 kb Genoteca genómica FAGÉMIDO Híbrido plásmido/fago De 4 a 10 kb YAC Levadura, cromosoma artificial Levadura De 200 a 1.000 kb BAC Cromosoma artificial de bacteria De 100 a 500 kb PAC Virus, DNA circular 80 kb