ESTUDIO DE CASO DE UNA POBLACIÓN EXPUESTA A PAH EN MÉXICO Dra. Ania Mendoza Cantú

Determinación del genotipo y fenotipo del CYP1A2 en una población expuesta a Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL IPN Q.F.B. Fabiola Castorena Torres Sección Externa de Toxicología

* Sólidos a temperatura ambiente * Altos puntos de fusión * Lipofílicos Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH) NaftalenoAntraceno Fluoreno Pireno Benzo[a]pireno Criseno

Efectos Tóxicos de los PAH en el Humano Dosis letal oral (mg) adulto 2000 niño Se requieren altas concentraciones * Toxicidad aguda Se requieren altas concentraciones de PAH para presentar toxicidad aguda Efectos degenerativos, principalmente procesos cancerígenos entre los que se encuentran cáncer de pulmón, piel, vejiga, esófago, laringe y lengua, entre otros *Toxicidad crónica Efectos degenerativos, principalmente procesos cancerígenos entre los que se encuentran cáncer de pulmón, piel, vejiga, esófago, laringe y lengua, entre otros

Biomarcadores a PAH Daño Cáncer EfectoTemprano Inducción de CYP1A2 Exposición BaseGenética Fenotipo Genotipo

Polimorfismo Genético del CYP1A2 MutaciónFrecuencia%EfectoReferencia Región del promotor ( n=116) 77 G/G 18 G/A 5 A/A Actividad Nakajima y cols.,1999. Intrón (n=216) 10 C/C 44 C/A 46 A/A Actividad Sachse y cols., ´ ´ P1f P4f R2 R3 Bsp120I 15q BslI

Evaluar en una población la relación entre fenotipo y el genotipo del CYP1A2 con la exposición a PAH Objetivo General

2. Evaluar el fenotipo del CYP1A2 (indicador de efecto temprano) Actividad enzimática mediante el CMR Contenido de mRNA Objetivos Particulares 1. Evaluar la exposición a PAH mediante la cuantificación de 1-OH pireno 1. Evaluar la exposición a PAH mediante la cuantificación de 1-OH pireno en orina (indicador de exposición) en orina (indicador de exposición) 3. Determinar el genotipo del CYP1A2 (indicador de susceptibilidad) 3. Determinar el genotipo del CYP1A2 (indicador de susceptibilidad) 4. Determinar la relación estadística entre los parámetros evaluados 4. Determinar la relación estadística entre los parámetros evaluados

REGIÓN CARBONÍFERA (Hornos de Coquizado) -BARROTERAN, Muz. -CLOETE, Sab. -JUÁREZ, Jua.

Diseño del estudio Cuestionario Toma de muestra Contempló: Estilo de vida, hábitos alimenticios historia clínica, historia laboral Participaron 46 individuos Participaron 46 individuos 14 individuos de Barroterán 14 individuos de Barroterán Muestreo 13 individuos de Cloete 19 individuos de Juárez 19 individuos de Juárez Individuos sanos, mayores de 18 años, Individuos sanos, mayores de 18 años, Criterios de inclusión de sexo masculino, que firmaran el consentimiento informado consentimiento informado que pertenecieran a la zona de estudio que pertenecieran a la zona de estudio Diseño de corte transversal, muestreo por conveniencia

Estrategia del Estudio Estrategia del Estudio Cuestionario Muestreo Cuestionario Muestreo Sangre –EDTA Sangre –EDTA Sangre Suero Sangre Suero DNA mRNA Polimorfismo CYP1A2 Cuantificación mRNA Pruebas de funcionamiento hepático y renal Orina Metabolitos cafeína 1-OHP

Determinación del 1-hidroxipireno Determinación del 1-hidroxipireno (Jongeneelen y cols., 1986) (Jongeneelen y cols., 1986)

Niveles de 1- Hidroxipireno por poblado ± 1.53 (n.d – 6.38) ± 0.98 (n.d -2.80) ±0.076 (n.d – 0.453) ± 1.66 Barroterán (trabajadores) Intervalo Cloete (ex-trabajadores) IntervaloJuárezIntervaloTotal n 1-OHP ( mol/mol creatinina) ( mol/mol creatinina) media ± D.S Poblado n.d-. Niveles que están por debajo de 1 nmol/L. El Limite de Evaluación Biológica para la TRK (Guía Técnica Alemana) es de mol/mol de creatinina

Determinación del polimorfismo del CYP1A2

Polimorfismo en la Región del promotor del promotor (Nakajima y cols., 1999) Polimorfismo en el Intron I (Sachse y cols., 1999)

pb M C/C A/A C/A PCR-RFLP del gen CYP1A2 TGGGCCCAGGA A 734 Enzima de restricción Bsp120I

Frecuencia del Polimorfismo del CYP1A2 Polimorfismo genético CYP1A2 Genotipon Frecuencia%Total(n) Región del promotor (-2964) Intrón I (734)G/GG/AA/AC/CC/AA/A

Evaluar el fenotipo del CYP1A2

Determinación de la actividad enzimática del CYP 1A2 (CMR) (Extracción por el método modificado de Grand y cols., 1983 y la determinación por HPLC por el método de Berthou y cols., 1989)

Relación de los Metabolitos de la Cafeína en Orina Índice de la actividad enzimática del CYP1A2 (CMR) CYP1A2 = (AFMU+1-MU+1-MX) 1,7-DMU (Campbell y cols., 1987)

Análisis semicuantitativo del mRNA (Gilliland y cols., 1990 modificado por Vanden Hiuvel y cols., 1993 )

Muestras de sangre Extracción de RNA total PCR con oligos CYP1A2 Purificación de Linfocitos Ensayos de RT-PCR semicuantitativo cDNA- Kit comercial cDNA estándar GAPDH

El índice de la actividad enzimática del CYP1A2 se expresa como el CMR ( caffeine metabolic ratio), n.d niveles no detectables ( ) (n.d ) 2.51 ± ± 0.33 Actividad enzimática Niveles de mRNA del CYP1A2 Intervalo Promedio Nivel Promedio Variable Fenotipo del CYP1A2 en la Población Estudiada

Resultados de la población

Características Generales de la Población ± ± 1.69 ± ± 27 ± ± ± 19 Edad (años) Peso (kg) Talla (m) IMC* TGO (U/L) TGP (U/L) Depuración de creatinina (ml/min) + IntervaloPromedio ± D.SCaracterísticas de la población

Análisis de Estadístico

Variables Evaluadas Estratificadas por Genotipo Nativo n=18 Heterocigoto n=17 Homocigoto mutado n=11 IMC + Media ± S.D Intervalo 1-OHP Media ± S.D Intervalo Actividad CYP1A2 Media ± S.D Intervalo mRNA Media ± S.D intervalo ±1.25 ( ) ± ( ) 1.31 ± ( ) ± ( ) ± 5.67 ( ) ± 0.84 ( ) 1.45 ± 2.66 ( ) ± (0.45 ± ) ± 3.50 ( ) ± ( ) ± 3.26 ( ) ± 2.77 ( ) Variable Promotor Promotor

IMC + Media ± S.D Intervalo 1-OHP Media ± S.D Intervalo mRNA Media ± D.S Intervalo Actividad CYP1A2 Media ± S.D Intervalo (p<0.001), valores similares a los detectados por Sachse, y cols., 1999 (C/A 0.82, A/A 1.37) *Expresado como la media geométrica, + Índice de masa corporal expresado como Kg/m 2, Expresado en mol/mol de creatinina, actividad enzimática dada por la relación de [(AFMU+1MX+1MU)/17DMU], aplicando la prueba estadística de ANOVA, (p<0.001), valores similares a los detectados por Sachse, y cols., 1999 (C/A 0.82, A/A 1.37) Variable Intrón I Heterocigoto n=20 Homocigoto mutado n= ± 4.86 (21.0 – 27.02) 1.08 ± 1.35 (0.087 – 3.30) ± ( ) ± 2.86 (1.11 – 4.76) ± 5.63 (20.54 ± 39.06) ± 2.40 (0.009 – 6.38) ± ( ) 1.99±2.53 (1.32 – 12.70)

Tabaquismo, consumo de alimento con cierta carga de PAH, consumo de bebidas, alimentos y golosinas con cierta carga de cafeína, consumo de alcohol Aplicando la prueba estadística de ANOVA, con una p>0.05 Posibles factores que nos pudieran dar un cambio en la actividad enzimática del CYP1A2 o en los niveles de 1-OHP

Relación entre la actividad enzimática el nivel de 1-OHP y el polimorfismo en el intrón I del CYP1A2 Aplicando una regresión lineal, A/A ( = , r 2 b= 0.059, r 2 r 2 =0.096 p=0.50 ), C/A (b= 0.059, r 2 =0.049 p=0.50) Aplicando una regresión lineal, = , Aplicando una regresión lineal, = , r 2 r 2 = 0.18, p<0.001 C/C Nativo, C/A Heterocigoto, /A Homocigoto mutado C/C Nativo, C/A Heterocigoto, A/A Homocigoto mutado C/C C/A A/A (P<0.001) CMR Urinaria (Log) C/ A CMR Urinaria (Log) 1- OHP ( mol/mol de creatinina) A/A C/A

Conclusiones 1.La mutación localizada en el intrón I Para el alelo mutado (A/A) observó una frecuencia de 76%, el cual está relacionado con un incremento en la actividad enzimática CYP1A2 y puede ser un factor de riesgo en algunas alteraciones asociadas con la exposición PAH (cáncer) 2. La variabilidad fenotípica observada en los individuos mutados con respecto a los heterocigotos para el polimorfismo en el intrón I fue estadísticamente significativa (p<0.001)

3. Para la mutación en el promotor (-2964) la frecuencia del alelo mutado fue del 58% y para el aleo nativo fue del 42%. No se observó una diferencia entre este polimorfismo y la actividad del CYP1A2 4. Existe una tendencia a presentarse mayor actividad enzimática del CYP1A2 respecto a los niveles de exposición. 5. No existe relación entre los niveles de exposición y los niveles del mRNA para esta isoforma Conclusiones