PARTE II CAPÍTULO 11 METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados.

Figura 11-1. Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo Figura 11-1. Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo. Esta técnica es ampliamente usada por su economía y facilidad, lo que permite el aislamiento de ADN de buena calidad para su uso en diversas técnicas moleculares. Es importante considerar que el procedimiento se debe realizar en frío (4°C) después de la digestión enzimática. Una vez extraído se almacena a temperatura de –80°C para su preservación adecuada por varios años. CAPÍTULO 11. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 11-2. Fases en la purificación de ácidos nucleicos Figura 11-2. Fases en la purificación de ácidos nucleicos. En la extracción de ácidos nucleicos que involucra solventes orgánicos, una vez que estos últimos son añadidos se forman dos fases: la fase fenólica, ubicada en la parte inferior de tubo, la cual contiene proteínas y lípidos. A su vez, la fase superior es la acuosa, donde se ubica el ADN o ARN, según sea el caso. En la interfase entre ambas se localiza un acúmulo sólido de proteínas. La separación de la fase acuosa sin tocar la fase fenólica o la capa de proteínas es un paso crítico en el proceso de extracción del ácido nucleico que determina la pureza con que se aísla, y por lo tanto es determinante del índice 260/280 que se obtenga. CAPÍTULO 11. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 11-3. Fundamento del funcionamiento del espectrofotómetro Figura 11-3. Fundamento del funcionamiento del espectrofotómetro. La luz UV o visible es emitida por una lámpara que a través de un condensador dirige los rayos hacia la muestra, ubicada dentro de una celda de cuarzo (material que no interfiere con la absorción de la muestra). La luz será absorbida de manera proporcional de acuerdo a la concentración de la muestra. La luz que no es absorbida por la muestra se mide por el detector, restándola a la luz inicial emitida y generando así una lectura en unidades de absorbancia que oscila entre 0.001 a 1.000. CAPÍTULO 11. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 11-4. Extracción de ARN con fenol-cloroformo Figura 11-4. Extracción de ARN con fenol-cloroformo. La extracción de ARN es una modifi cación de la extracción de ADN por fenolcloroformo. La principal diferencia es el empleo de inhibidores de ARNsas con la idea de impedir la degradación del ARN por las endonucleasas intracelulares de la muestra o presentes en el material. Es importante mencionar que la extracción de ARN debe realizarse en todo momento en frío (4°C) para inhibir la acción de las ARNsas, cuidando que los reactivos estén en refrigeración antes y durante su empleo. CAPÍTULO 11. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE