Técnicas de Secuenciación de DNA Dante Travisany F.

Tópicos Objetivos Avances Sanger: EST Next Generation Sequencing NGS: Chain Terminator Shotgun Sequencing EST Next Generation Sequencing NGS: Sequencing By Synthesis Illumina – SBS. Roche 454 – Pyrosequencing SOLiD – Ligation Sequencing Semiconduction Sequencing – Ion Torrent.

Objetivo ATCGATCGATCGATCAGCTACGATCGATCGATCGATCGATCGATCAGCATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCATTTATATTCTGCCGTACGACCTGACTGATCTGATCGAGTCGATCGACTACATATCGATCGATCGACGATCGTACGTATGCATGCGATCGTATCGAGTCGTACTACGAGTCGACTGATCGTAGTATATATGCAGCGATCGATGATCGAGTCGATGTATTCTGACGCGATCTGAGTCTGATGCCGTAGCAACGCTATGCTACTAGCTGACGTCATGCGTACGTAGTCGTAGTACGTATCGATGCTGATGCAC

Objetivos Conocer: Las bases de la secuenciación de ADN Principales tecnologías de Secuenciación Aplicaciones de la secuenciación de ADN

Actualmente

Presente / Futuro cercano Costos: Dinero Computacionales Tiempo

Sanger 1977: F. Sanger y W. Gilbert - DNA Sequencing

dTTP dCTP dATP Extremo 3’ dGTP

ACTGXXXXXXXXXX TGAC X X G- X X X TGACXXG TGACXXXXXXXXG TGACXG

G ACT T C G T A 5’ 3’ TGACXXG TGACXXXXXXXXG TGACXG TGACA TGACXXXXXXXA TGACXXXXXXC TGACXXXC TGACXXXXXT TGACXT TGACXXXXT G ACT T C G T A 5’ 3’

Sanger 1982: F. Sanger – Shotgun Sequencing 48.502 Nucleótidos - Primer Fago Secuenciado Se agrega un nuevo protocolo.

Shotgun Sequencing

1987 - Primera Secuenciadora ABI 370

Phred Quality Values Phred : Software que realiza el basecalling. Q = -10 log(Pe) Phred quality score Probability that the base is called wrong Accuracy of the base call 10 1 in 10 90% 20 1 in 100 99% 30 1 in 1,000 99.9% 40 1 in 10,000 99.99% 50 1 in 100,000 99.999%

Ejemplo Output Phred

ESTs Se capturan los mRNA mRNA -> cDNA Se ensamblan los transcritos Transcriptoma

Next Generation Sequencing

Introducción a la SBS Secuenciación por Síntesis Enzimas: Tipo: Ligasa Polimerasa Tipo: Single Molecule Basada en ensamble Ejecución: Tiempo Real Controlada Sincrónicamente

Secuenciación Por Síntesis Solexa/Illumina: Polimerasa, Sincrónica, Basada en Ensamble

Illumina - SBS Se fragmenta el DNA Se reparan los extremos Se agregan los adaptadores

Illumina - SBS Se agrega el DNA a la placa Se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que estan en la placa

Illumina - SBS Se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa. Comienza la amplificación

Illumina - SBS Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificación puente. Se han generado millones de Clústers en la placa.

Illumina - SBS Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular: G - Amarillo. C – Azul A – Rojo T - Verde Se excita con un laser y se captura una imagen.

Illumina - SBS Se excita con un laser y se captura una imagen. La imagen capturada en una posición específica corresponde al primer nucleótido.

Illumina - SBS

Illumina - SBS Los ciclos de secuenciación se repiten hasta determinar la secuencia del templado. Una base a la vez.

Secuenciación Por Síntesis Roche 454 - Pirosecuenciación: Polimerasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS El DNA es Nebulizado Se fragmenta en tamaños aleatorios

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS Se agregan adaptadores universales (Adaptador A’ y B’) a los Extremos Se denatura

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS Cada Perla ‘bead’ contiene miles de adaptadores, pero solo se le adhiere un fragmento de DNA que queda atrapado en una emulsión que contiene en su interior los elementos para una PCR.

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS El DNA se amplifica en esta emulsión Generando cientos de copias en cada perla

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS Estas son puestas en la PicoTiter Plate (PTP). El diseño de esta permite una bead por orificio.

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

454 summary Run time: 8 Hrs Produce 100's Mb of seq Read length: 300bp – 400bp 2011 → 740bp!!! Applications and Challenges De novo sequencing Metagenomics Gene expression Variation detection Homopolymers problem

Secuenciación Por Síntesis ABI - Secuenciación por Ligación: Ligasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

Sequenciación por Ligación - SBS

Secuenciación por Semiconducción Ion Torrent

Secuenciación por Semiconducción Al incorporarse un núcleotido a la hebra de ADN, la polimerasa libera un ion Hidrógeno.

Secuenciación por Semiconducción Matriz de alta densidad de pozos que permiten generar este proceso paralelamente Cada pozo secuencia una hebra.

Secuenciación por Semiconducción

Secuenciación por Semiconducción

Secuenciación por Semiconducción

Comparación Métodos

454 Vibrio parahaemolyticus Phred Qual

Ion Torrent - Vibrio parahaemolyticus Phred Qual

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación De novo Genome Assembly Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa.

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación De novo Genome Assembly (454 o Illumina) Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa. Tamaño del Genoma Coverage esperado Coverage real Complejidad del Genoma Capacidad de Cómputo

Panda Genome 2.25 Gigabases -> 2.250.000.000 de núcleotidos cubrieron el 94% del genoma. Sólo se utilizo Illumina. Se utilizaron especies de referencia para formar los cromosomas.

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación Metagenómica (454) Estudio de los metagenomas, secuenciación del material genetico obtenido desde el ambiente / organismo. Clasificación Taxonómica Perfil Metabólico

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación Metagenómica

Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación Genome Mapping (Illumina / SOLiD) Secuenciación con referencia, permite identificar variantes inter/intra especies. Variaciones estructurales, cambios en los genomas. SNPs Variantes estructurales

Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación RNA –Seq Mapping (Illumina / SOLiD) Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones Expresión Diferencial SNPs Isoformas

Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación RNA –Seq De novo (Illumina) Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones, reconstrucción del transcriptoma en un organismo, condición específico Obtención transcriptoma Expresión Diferencial SNPs

Gracias

Illumina –Fluorescent Reverse Terminator