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Estudio de la trazabilidad sensorial de los aceites elaborados en el suroeste de la península Ibérica. OLITRACE2 Universidad de Huelva Rafael Beltrán Lucena.

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1 Estudio de la trazabilidad sensorial de los aceites elaborados en el suroeste de la península Ibérica. OLITRACE2 Universidad de Huelva Rafael Beltrán Lucena Ana Sayago Gómez Valeria Gallo Mazzuchino María Beltrán Muníz Mariluz Pizarro Hierro Mercedes Becerra Herrera Instituto de la Grasa- CSIC Diego L. García González Ramón Aparicio López María Teresa Morales Millán Instituto Politécnico de Beja Manuel Joaquín Marques Patanita Isabel Maria Pereira Caldas Baer Universidade do Algarve Ana Cristina Figueira

2 INDICE 1.OBJETIVOS 2.TAREAS REALIZADAS 3.METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD 4.RESULTADOS 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro (Algarve) y Beja (Alentejo) 5.2. Huelva y Distrito de Beja 5.3. Huelva

3 1. OBJETIVOS

4 Relacionar la evolución de los compuestos fenólicos con el proceso de recolección de la aceituna y de extracción del aceite en almazaras seleccionadas. Sugerir posibles mejoras en el proceso integral de extracción del aceite de oliva virgen (Good Manufacturing Process). Interpretar la caracterización sensorial de los aceites, según panel de expertos de las almazaras, en función de la composición química de los aceites. Diseñar un modelo de operativo de funcionamiento para mantener una calidad sensorial distintiva de los aceites onubenses 1. OBJETIVOS

5 Diagrama de flujo del plan de trabajo propuesto

6 Puesta a punto de las técnicas analíticas necesarias para la determinación de fenoles. Estudio estadístico de los datos relacionados con la trazabilidad sensorial Intercambio de información entre los miembros del equipo de trabajo Difusión de los resultados Determinación de compuestos fenólicos (HPLC) Búsqueda Bibliográfica 2. TAREAS REALIZADAS

7 Se utilizó un HPLC-DAD Agilent Se aplicó un gradiente de fase A (agua/metanol/ácido acético 93:5:2 v/v/v) y fase B (metanol/ácido acético 98:2 v/v) en fase reversa con una columna Nova-pack C18. El flujo utilizado fue de 1 mL/min y la temperatura se mantuvo a 20ºC. 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD

8 Los compuestos fenólicos eluyen en función a su polaridad; así, los feniletilalcoholes eluyen los primeros, antes de los 45 minutos, mientras que los flavonoides eluyen tras los 60 minutos, cuando incrementa la concentración de metanol en la fase móvil. La identificación de los fenoles se realiza a tres longitudes de onda diferentes (280 nm, 320 nm y 360 nm). La cuantificación se logra utilizando curvas de calibración externa con cada uno de los patrones de fenoles. Todos los análisis se realizan por triplicado y los resultados se expresan como la media de los valores obtenidos. 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD

9 mAU min mAU min mAU mAU min mAU a)b)c) d)e)f) Perfiles de elución de los fenoles en un multipatrón (a,b,c) y extracto de aceite de oliva virgen extra var. picual (d,e,f) a 280nm (a,d), a 320 nm (b,e) y a 360 nm (c, f). 1: Ácido gálico; 2: Hidroxitirosol; 3: Tirosol; 4: Ácido vainílico; 5: Ácido Cafeico; 6: Vainilina; 7: Ácido p-cumárico; 8: Ácido sinápico; 9: Ácido o-cumárico; 10: Rutina; 11: Oleuropeina; 12: Luteolina; 13: Apigenina. 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD

10 Como se muestra en los cromatogramas, se ha realizado una extracción de los fenoles en las muestras de aceite excelente que nos ha proporcionado los resultados que se muestran en las imágenes. Se realizó la repetitividad y la reproducibilidad del método que se ha descrito y se obtuvieron valores de R.S.D < 10% para la mayoría de los compuestos fenólicos estudiados. Se han podido comparar estos resultados con los obtenidos por los patrones para la identificación y cuantificación de los mismos. Con la numeración señalada en los cromatogramas, se puede observar la identificación de cada fenol en nuestras muestras de aceites gracias al tiempo de retención y al espectro característico que tiene cada uno. M. Becerra, M. L. Pizarro, A. Sayago, M. Beltrán, R. Beltrán,"Comparison of different extraction methods to determine phenolic compounds in virgin olive oil", 13ª Jornadas de Análisis Instrumental, Barcelona, Spain, noviembre de METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD

11 Picual Arbequina Verdial Cobrançosa Cordovil Galega Hojiblanca Olicer Pecoliva Maçanilha Cobrançosa Picual Verdeal Blend ZONAS DE MUESTREO

12 Tabla.- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Niebla Ac. GalicoHidroxitirosolTirosolAc. VainillicoAc. CafeicoVainillinap-Cumaricoo-CumaricoOleuropeinaRutinaLuteolinaApigenina FANA1n.d.1,63540,0932n.d. 0,1586n.d.5,675855,83940,87620,89480,2698 FANA2n.d.1,5112n.d. 0,1586n.d.13,845033,91430,96350,43810,0391 FANA3n.d.1,66640,0893n.d. 0,1474n.d.22,827149,32480,96830,1753n.d. FANA4n.d.1,2846n.d. 0,07500,094718,386357,70550,60192,11380,4300 FANA5n.d.1,3320n.d. 0,12230,031314,225446,58190,58991,21730,2493 FANA6n.d.1,1189n.d. 0,22270,01215,799169,53871,15840,90500,1903 FANA7n.d.1,0500n.d. 0,16460,00716,355983,17631,16000,88980,2425 FANA8n.d.1,2884n.d. 0,17000,04769,562673,01151,21120,84590,2335 FANA9n.d.2,0825n.d. 0,03420,070110,118231,95750,40811,12050,1339 FANA10n.d.1,7739n.d. 0,25380,044812,836562,45430,99651,16720,3712 FANA11n.d.2,34800,0237n.d. 0,07440,01186,240389,67530,66910,6123n.d. FANA12n.d.2,14400,0588n.d. 0,0928-0,00405,444580,13360,61500,58540,1535 FANA13n.d.1,2853n.d. 0,1908n.d.7,470963,44831,04492,06080,7102 FANA14n.d.1,13180,8257n.d. 0,27670,20703,667861,92051,3553n.d. FANA15n.d.0,86810,5496n.d. 0,25360,12891,077141,88941,2810n.d. FANA16n.d.1,18160,6384n.d. 0,31250,12554,340757,28741,3505n.d. FANA17n.d.1,03300,4243n.d. 0,22020,12680,831539,53311,2895n.d. FANA18n.d.1,67200,4457n.d. 0,20040,10544,601765,28930,9878n.d. FANA19n.d.0,9897n.d. 0,22550,01832,414247,43311,0913n.d. FANA20n.d.1,10060,0178n.d. 0,22690,01252,357646,79571,0855n.d. FANA21n.d.1,82210,3990n.d. 0,17930,12505,479470,74100,6846n.d. FANP1n.d.7,92903,33450,1359n.d.0,12510,37533,535639,36620,2975n.d. FANP2n.d.7,93433,18860,2871n.d.0,13640,36523,437834,54810,27520,0298n.d. FANP3n.d.8,58433,39970,1106n.d.0,13950,36453,594038,91340,28350,0878n.d. FANP4n.d.12,20712,99330,0758n.d.0,08860,02847,036166,4426n.d. FANP5n.d.15,86552,99190,0823n.d.0,09190,04558,162079,42460,1630n.d. FANP6n.d.10,41711,9569n.d. 0,11930,01778,544469,54470,2464n.d. 4. RESULTADOS

13 Tabla.- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Beas Ac. GalicoHidroxitirosolTirosolAc. VainillicoAc. CafeicoVainillinap-Cumaricoo-CumaricoOleuropeinaRutinaLuteolinaApigenina FABA1n.d.2,75260,19960,0684n.d.0,21780,18336,456494,88650,62584,68941,0418 FABA2n.d.2,12090,18950,1587n.d.0,24110,21076, ,91200,68643,50020,8485 FABA3n.d.2,32230,34130,2524n.d.0,31370,27247, ,44480,85663,28320,8156 FABA4n.d.2,32940,10860,2589n.d.0,22360,18696,343841,93210,49292,55270,6360 FABA5n.d.2,36390,32400,2037n.d.0,25330,20656,087842,42620,68492,83350,7216 FABA6n.d.2,47770,01740,2163n.d.0,20450,14927,428253,91520,64272,55740,6137 FABA7n.d.2,60700,50710,2006n.d.0,22410,10407,478953,70850,65072,65900,6232 FABA8n.d.1,66140,00570,1987n.d.0,22290,13228,026057,40460,60252,85840,6622 FABA9n.d.2,97170,64740,3952n.d.0,28160,28855,792242,13500,80213,35060,8023 FABA10n.d.4,15290,94700,4880n.d.0,36510,38667,503052,52301,01944,07950,9876 FABP1n.d.5,96401,54960,1139n.d.0,15710,20373,756849,61130,31661,40880,4181 FABP2n.d.6,29931,81550,1282n.d.0,16390,23434,244655,98890,33841,64870,5063 FABP3n.d.7,80132,35350,2369n.d.0,14230,26714,197054,66670,26961,61630,4971 FABP4n.d.7,23042,01090,2521n.d.0,12330,24043,985152,37720,25291,63600,4829 FABP5n.d.8,11232,29880,2532n.d.0,14680,28514,481358,31740,30001,68950,5174 FABP6n.d.5,95653,33660,4583n.d.0,06320,18082,641548,55530,32552,14260,5645 FABP7n.d.5,54732,66920,4534n.d.0,09470,18373,186149,40480,29232,06100,5614 FABP8n.d.4,48632,37110,2640n.d.0,07490,14712,943876,63670,30811,94440,5692 FABP9n.d.5,47001,62690,1687n.d.0,18490,23613,259541,61620,34541,76180,8098 FABP10n.d.5,14672,45010,3852n.d.0,10190,18062, ,00140,20871,59010,3917 FABV1n.d.17,801211,92560,1883n.d.0,08630,13345, ,38710,21680,04060,0237 FABV2n.d.19,980211,69900,0356n.d.0,06340,16776, ,79760,19040,05070,0407 FABV3n.d.19,713711,51690,0719n.d.0,06820,16296, ,00470,2003n.d. FABV4n.d.27,182613,87660,0626n.d.0,06140,20765, ,09940,17210,04380,0340 FABV5n.d.28,098316,63630,2886n.d.0,05040,33225, ,36070,20210,02050,0004 FABV6n.d.27,883416,51000,2927n.d.0,04930,33765, ,18490,15800,03910,0361 FABV7n.d.30,836516,34150,1721n.d.0,03970,33485, ,21010,15200,15210,1065 FABV8n.d.23,064114,03840,2498n.d.0,07800,23475, ,22240,17680,08900,0785 FABV9n.d.23,928214,14930,3385n.d.0,06840,26094,349293,12040,14990,12220,1270 FABV10n.d.24,057614,27800,2570n.d.0,04040,24714, ,20180,16320,0109n.d. 4. RESULTADOS

14 Tabla.- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Sanlúcar del Guadiana Ac. GalicoHidroxitirosolTirosolAc. VainillicoAc. CafeicoVainillinap-Cumaricoo-CumaricoOleuropeinaRutinaLuteolinaApigenina FASA1n.d.1,1276n.d. 0,33760,085910,602661,41911,25622,43800,6278 FASA2n.d.0,9523n.d. 0,29070,002413,023053,21721,29421,51490,4127 FASA3n.d.2,4891n.d. 0,2017-0,010914,619136,18691,06762,10920,4159 FASA4n.d.1,1099n.d. 0,29310,093610,100341,00671,14132,34250,5563 FASA5n.d.1,6017n.d. 0,25450,050915,390439,53010,98242,53570,6349 FASA6n.d.3,09850,2994n.d. 0,17100,174113,230943,14020,71683,48480,8090 FASA7n.d.2,44550,5721n.d. 0,20640,14125,898277,47700,85321,92550,5497 FASA8n.d.2,14880,8585n.d. 0,21820,15977,052890,47720,85872,27920,6255 FASA9n.d.1,53650,40220,0282n.d.0,21650,10544,059058,90310,81342,22550,6964 FASA10n.d.1,2435n.d. 0,18600,00927,675464,56280,99561,88410,6432 FASA11n.d.1,4579n.d. 0,1753n.d.7,806766,54451,02701,73300,6176 FASP1n.d.6,44801,6746n.d. 0,16960,073010, ,69090,3656n.d. FASP2n.d.6,75341,7861n.d. 0,16690,059510, ,82460,3050n.d. FASP3n.d.8,73243,10230,1283n.d.0,15380,15793,217754,15190,2666n.d. FASP4n.d.11,40833,59490,0148n.d.0,11990,21064,179544,82150,2499n.d. FASP5n.d.8,00502,6124n.d. 0,13800,22653,989842,43460,24090,0854n.d. FASP6n.d.5,98912,1734n.d. 0,16260,136810, ,65710,4010n.d. FASP7n.d.7,26932,89370,0962n.d.0,12860,20933,043937,80500,32330,0044n.d. FASP8n.d.9,17452,8361n.d. 0,15740,21664,044740,50750,22260,0317n.d. 4. RESULTADOS

15 Tabla.- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Gibraleón Ac. GalicoHidroxitirosolTirosolAc. VainillicoAc. CafeicoVainillinap-Cumaricoo-CumaricoOleuropeinaRutinaLuteolinaApigenina FAGV1n.d.31,150518,71960,1820n.d.0,02290,44213,478970,57130,15880,13730,1305 FAGV2n.d.19,998712,84180,0671n.d.0,12670,24086, ,28750,15020,07100,0435 FAGV3n.d.19,184114,9155n.d. 0,02750,18143,250575,66670,17240,06810,0626 FAGV4n.d.21,267415,98800,0056n.d.0,04780,23972,603460,71440,1627n.d.0,0105 FAGV5n.d.26,657311,5472n.d. 0,02570,00994,337586,83930,17740,19140,1057 FAGA1n.d.7,73570,7245n.d. 0,1929n.d.6,446829,07670,64130,23810,0948 FAGA2n.d.5,04430,1432n.d. 0,1737n.d.6,358930,96290,52670,13790,0341 FAGA3n.d.3,6764n.d. 0,1244n.d.6,579833,26750,51460,12040,0068 FAGA4n.d.3,8173n.d. 0,1256n.d.7,191537,61010,47130,49180,1163 FAGA5n.d.3,3621n.d. 0,1839n.d.8,510853,56250,59690,18960,0450 FAGP1n.d.21,92014,40340,4207n.d.0,06140,03292,051126,65730,16130,42970,0794 FAGP2n.d.18,08375,06480,0526n.d.0,50950,03392,965939,51220,27520,13500,0096 FAGP3n.d.15,68053,14730,1552n.d.0,12000,20994,891348,08370,32090,07890,0099 FAGP4n.d.13,36433,00660,3087n.d.0,10440,17155,595647,62790,2798n.d. FAGP5n.d.25,57873,85230,5905n.d.0,12760,19526,935489,84600,49790,08150, RESULTADOS

16 Tabla.- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes del Distrito de Beja (Alentejo) Ac. GalicoHidroxitirosolTirosolAc. VainillicoAc. CafeicoVainillinap-Cumaricoo-CumaricoOleuropeinaRutinaLuteolinaApigenina FADB1n.d.2,92140,3665n.d. 45,9677n.d.1,09500,3368 FADB2n.d.14,35299,3649n.d. 1,107337,8215n.d.1,08790,7268 FADB3n.d.10,961318,4227n.d. 0,08970,525746,2109n.d.0,81590,4983 FADB4n.d.17,321511,6895n.d. 0,10880,619937,0246n.d.0,89010,5397 FADB5n.d.9,027915,2290n.d. 0,00621, ,4909n.d.0,63060,3262 FADB6n.d.3,85111,5358n.d. 0,08750,835385,8921n.d.2,39661,2218 FADB7n.d.11,481322,4462n.d. 0,06690,286758,9930n.d.0,75420,2698 FADB8n.d.8,64015,2104n.d. 0,09421,915540,0029n.d.1,62860,8425 FADB9n.d.14,89454,4917n.d. 0,0124n.d.81,0853n.d.1,12210,5465 FADB100,40397,05841,8691n.d. 44,1198n.d.0,82380,1184 FADB11n.d.3,21222,3253n.d. 0,1156n.d.86,3820n.d.2,74090,7669 FADB12n.d.6,90465,3009n.d. 0,29290,648361,2265n.d.3,28211,6589 FADB13n.d.0,8601 n.d. 3,6951n.d. FADB14n.d.0,7221 n.d. 6,2224n.d.0,0001 n.d. FADB15n.d.5,78204,0938n.d. 4,5505n.d.0,0212 n.d. FADB16n.d.2,28234,2150n.d. 6,2785n.d.0,0850 n.d. FADB17n.d.1,30734,3785n.d. 5,5350n.d. 4. RESULTADOS

17 Tabla.- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes del Distrito de Faro (Algarve) Ac. GalicoHidroxitirosolTirosolAc. VainillicoAc. CafeicoVainillinap-Cumaricoo-CumaricoOleuropeinaRutinaLuteolinaApigenina FAAL10,040,015,195,331,414,4510,750,0327,9633,620,025,19 FAAL20,04n.d.5,185,331,445,676,460,010,2436,50,03n.d. FAAL3n.d.10,363,962,69,313,536,6820,491,04n.d.4,346,04 FAAL40,060,354,22,022,952,494,79n.d. FAAL51,33n.d.1,380,780,380,225,183,712,61n.d.3,660,01 FAAL6n.d. 1,620,480,610,140,530,120,010,270,024,06 FAAL70,040,90,02n.d.0,010,190,050,070,090,01n.d.0,09 FAAL8n.d.2,6312,112,832,280,850,010,031,021,181,47 4. RESULTADOS

18 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO Con el tratamiento estadístico de los resultados se pretende conocer el comportamiento de muestras con diferentes procedencias y variedades en función de su contenido fenólico. Al realizar un Análisis de Componentes Principales (PCA) inicial con todas las muestras, se observa como las procedentes del Distrito de Faro se diferencian de las procedentes del Distrito de Beja y de Huelva de forma significativa, esto puede ser debido a pequeñas modificaciones llevadas a cabo durante el proceso de análisis o bien a que se tratan de aceites de características muy diferentes al resto en cuanto a su contenido fenólico Huelva y Distritos de Faro y Beja

19 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja

20 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO Del mismo modo, el Análisis Canónico (CA) llevado a cabo teniendo en cuenta todos los fenoles corrobora los resultados obtenidos previamente mediante PCA, donde puede observarse claramente como las muestras procedentes del Distrito de Faro se diferencian notablemente del resto Huelva y Distritos de Faro y Beja

21 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.2. Huelva y Distrito de Beja Con el fin de reducir el número de variables, se dispone a realizar un Análisis Discriminante por pasos el cual determina, que con sólo 6 fenoles de los 12 totales se consigue diferenciar los aceites procedentes de Huelva de los procedentes del Distrito de Beja. Siendo los 3 primeros fenoles los más significativos a la hora de diferenciar las muestras procedentes de Huelva de las de Beja dado su reducido valor del p-level (error).

22 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.2. Huelva y Distrito de Beja

23 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.2. Huelva y Distrito de Beja En la figura de la derecha puede observarse como las muestras de Huelva se diferencian perfectamente de las procedentes de Beja tan solo teniendo en cuenta los fenoles clasificados anteriormente, debido entre otros aspectos a la ausencia de los mismos en las muestras procedentes del Distrito de Beja en comparación con los aceites procedentes de Huelva, salvo para la Apigenina donde la tendencia es inversa, tal y como puede apreciarse en los gráficos de la izquierda.

24 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.3. Huelva Para poder diferenciar los aceites procedentes de Huelva en función de la variedad a la que pertenecen (Arbequina, Picual y Verdial), se llevó a cabo un Análisis Discriminante por pasos (SLDA) seguido del correspondiente CA. El Tirosol y la Rutina pueden considerarse los fenoles claves a la hora de clasificar en función de la variedad dado su reducido valor del p-level (error).

25 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.3. Huelva El Análisis de Componentes Principales considerando únicamente las variables seleccionadas mediante SLDA (Tirosol, Rutina y Oleuropeina) muestra como las tres variedades se distinguen claramente, siendo la variedad Verdial la más diferenciada del resto, al igual que ocurre en el CA, esto puede ser debido en gran medida a la alta concentración de Tirosol que presenta en comparación con el resto de variedades.

26 Muchas gracias


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