Estudio de la trazabilidad sensorial de los aceites elaborados en el suroeste de la península Ibérica. OLITRACE2 Instituto de la Grasa- CSIC Diego L. García.

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1 Estudio de la trazabilidad sensorial de los aceites elaborados en el suroeste de la península Ibérica. OLITRACE2 Instituto de la Grasa- CSIC Diego L. García González Ramón Aparicio López María Teresa Morales Millán Instituto Politécnico de Beja Manuel Joaquín Marques Patanita Isabel Maria Pereira Caldas Baer Universidade do Algarve Ana Cristina Figueira Universidad de Huelva Rafael Beltrán Lucena Ana Sayago Gómez Valeria Gallo Mazzuchino María Beltrán Muníz Mariluz Pizarro Hierro Mercedes Becerra Herrera

2 INDICE OBJETIVOS TAREAS REALIZADAS
METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD RESULTADOS ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro (Algarve) y Beja (Alentejo) 5.2. Huelva y Distrito de Beja 5.3. Huelva

3 1. OBJETIVOS

4 1. OBJETIVOS Relacionar la evolución de los compuestos fenólicos con el proceso de recolección de la aceituna y de extracción del aceite en almazaras seleccionadas. Sugerir posibles mejoras en el proceso integral de extracción del aceite de oliva virgen (“Good Manufacturing Process”). Interpretar la caracterización sensorial de los aceites, según panel de expertos de las almazaras, en función de la composición química de los aceites. Diseñar un modelo de operativo de funcionamiento para mantener una calidad sensorial distintiva de los aceites onubenses

5 Diagrama de flujo del plan de trabajo propuesto

6 2. TAREAS REALIZADAS Búsqueda Bibliográfica
Puesta a punto de las técnicas analíticas necesarias para la determinación de fenoles. Estudio estadístico de los datos relacionados con la trazabilidad sensorial Intercambio de información entre los miembros del equipo de trabajo Difusión de los resultados Determinación de compuestos fenólicos (HPLC) Búsqueda Bibliográfica

7 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD
Se utilizó un HPLC-DAD Agilent 1260. Se aplicó un gradiente de fase A (agua/metanol/ácido acético 93:5:2 v/v/v) y fase B (metanol/ácido acético 98:2 v/v) en fase reversa con una columna Nova-pack C18. El flujo utilizado fue de 1 mL/min y la temperatura se mantuvo a 20ºC.

8 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD
Los compuestos fenólicos eluyen en función a su polaridad; así, los feniletilalcoholes eluyen los primeros, antes de los 45 minutos, mientras que los flavonoides eluyen tras los 60 minutos, cuando incrementa la concentración de metanol en la fase móvil. La identificación de los fenoles se realiza a tres longitudes de onda diferentes (280 nm, 320 nm y 360 nm). La cuantificación se logra utilizando curvas de calibración externa con cada uno de los patrones de fenoles. Todos los análisis se realizan por triplicado y los resultados se expresan como la media de los valores obtenidos.

9 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD
mAU 200 400 600 800 min 20 40 60 -5 5 10 15 25 30 35 1 2 3 4 6 7 9 11 13 1000 1200 -15 -10 8 12 a) b) c) d) e) f) Perfiles de elución de los fenoles en un multipatrón (a,b,c) y extracto de aceite de oliva virgen extra var. picual (d,e,f) a 280nm (a,d), a 320 nm (b,e) y a 360 nm (c, f). 1: Ácido gálico; 2: Hidroxitirosol; 3: Tirosol; 4: Ácido vainílico; 5: Ácido Cafeico; 6: Vainilina; 7: Ácido p-cumárico; 8: Ácido sinápico; 9: Ácido o-cumárico; 10: Rutina; 11: Oleuropeina; 12: Luteolina; 13: Apigenina.

10 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD
Como se muestra en los cromatogramas, se ha realizado una extracción de los fenoles en las muestras de aceite excelente que nos ha proporcionado los resultados que se muestran en las imágenes. Se realizó la repetitividad y la reproducibilidad del método que se ha descrito y se obtuvieron valores de R.S.D < 10% para la mayoría de los compuestos fenólicos estudiados. Se han podido comparar estos resultados con los obtenidos por los patrones para la identificación y cuantificación de los mismos. Con la numeración señalada en los cromatogramas, se puede observar la identificación de cada fenol en nuestras muestras de aceites gracias al tiempo de retención y al espectro característico que tiene cada uno. M. Becerra, M. L. Pizarro, A. Sayago, M. Beltrán, R. Beltrán,"Comparison of different extraction methods to determine phenolic compounds in virgin olive oil", 13ª Jornadas de Análisis Instrumental, Barcelona, Spain, noviembre de 2011.

11 ZONAS DE MUESTREO Cobrançosa Cordovil Galega Hojiblanca Picual
Arbequina Verdial Olicer Pecoliva Maçanilha Cobrançosa Picual Verdeal Blend

12 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Niebla Ac. Galico Hidroxitirosol Tirosol Ac. Vainillico Ac. Cafeico Vainillina p-Cumarico o-Cumarico Oleuropeina Rutina Luteolina Apigenina FANA1 n.d. 1,6354 0,0932 0,1586 5,6758 55,8394 0,8762 0,8948 0,2698 FANA2 1,5112 13,8450 33,9143 0,9635 0,4381 0,0391 FANA3 1,6664 0,0893 0,1474 22,8271 49,3248 0,9683 0,1753 FANA4 1,2846 0,0750 0,0947 18,3863 57,7055 0,6019 2,1138 0,4300 FANA5 1,3320 0,1223 0,0313 14,2254 46,5819 0,5899 1,2173 0,2493 FANA6 1,1189 0,2227 0,0121 5,7991 69,5387 1,1584 0,9050 0,1903 FANA7 1,0500 0,1646 0,0071 6,3559 83,1763 1,1600 0,8898 0,2425 FANA8 1,2884 0,1700 0,0476 9,5626 73,0115 1,2112 0,8459 0,2335 FANA9 2,0825 0,0342 0,0701 10,1182 31,9575 0,4081 1,1205 0,1339 FANA10 1,7739 0,2538 0,0448 12,8365 62,4543 0,9965 1,1672 0,3712 FANA11 2,3480 0,0237 0,0744 0,0118 6,2403 89,6753 0,6691 0,6123 FANA12 2,1440 0,0588 0,0928 -0,0040 5,4445 80,1336 0,6150 0,5854 0,1535 FANA13 1,2853 0,1908 7,4709 63,4483 1,0449 2,0608 0,7102 FANA14 1,1318 0,8257 0,2767 0,2070 3,6678 61,9205 1,3553 FANA15 0,8681 0,5496 0,2536 0,1289 1,0771 41,8894 1,2810 FANA16 1,1816 0,6384 0,3125 0,1255 4,3407 57,2874 1,3505 FANA17 1,0330 0,4243 0,2202 0,1268 0,8315 39,5331 1,2895 FANA18 1,6720 0,4457 0,2004 0,1054 4,6017 65,2893 0,9878 FANA19 0,9897 0,2255 0,0183 2,4142 47,4331 1,0913 FANA20 1,1006 0,0178 0,2269 0,0125 2,3576 46,7957 1,0855 FANA21 1,8221 0,3990 0,1793 0,1250 5,4794 70,7410 0,6846 FANP1 7,9290 3,3345 0,1359 0,1251 0,3753 3,5356 39,3662 0,2975 FANP2 7,9343 3,1886 0,2871 0,1364 0,3652 3,4378 34,5481 0,2752 0,0298 FANP3 8,5843 3,3997 0,1106 0,1395 0,3645 3,5940 38,9134 0,2835 0,0878 FANP4 12,2071 2,9933 0,0758 0,0886 0,0284 7,0361 66,4426 FANP5 15,8655 2,9919 0,0823 0,0919 0,0455 8,1620 79,4246 0,1630 FANP6 10,4171 1,9569 0,1193 0,0177 8,5444 69,5447 0,2464

13 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Beas Ac. Galico Hidroxitirosol Tirosol Ac. Vainillico Ac. Cafeico Vainillina p-Cumarico o-Cumarico Oleuropeina Rutina Luteolina Apigenina FABA1 n.d. 2,7526 0,1996 0,0684 0,2178 0,1833 6,4564 94,8865 0,6258 4,6894 1,0418 FABA2 2,1209 0,1895 0,1587 0,2411 0,2107 6,5196 100,9120 0,6864 3,5002 0,8485 FABA3 2,3223 0,3413 0,2524 0,3137 0,2724 7,9532 117,4448 0,8566 3,2832 0,8156 FABA4 2,3294 0,1086 0,2589 0,2236 0,1869 6,3438 41,9321 0,4929 2,5527 0,6360 FABA5 2,3639 0,3240 0,2037 0,2533 0,2065 6,0878 42,4262 0,6849 2,8335 0,7216 FABA6 2,4777 0,0174 0,2163 0,2045 0,1492 7,4282 53,9152 0,6427 2,5574 0,6137 FABA7 2,6070 0,5071 0,2006 0,2241 0,1040 7,4789 53,7085 0,6507 2,6590 0,6232 FABA8 1,6614 0,0057 0,1987 0,2229 0,1322 8,0260 57,4046 0,6025 2,8584 0,6622 FABA9 2,9717 0,6474 0,3952 0,2816 0,2885 5,7922 42,1350 0,8021 3,3506 0,8023 FABA10 4,1529 0,9470 0,4880 0,3651 0,3866 7,5030 52,5230 1,0194 4,0795 0,9876 FABP1 5,9640 1,5496 0,1139 0,1571 3,7568 49,6113 0,3166 1,4088 0,4181 FABP2 6,2993 1,8155 0,1282 0,1639 0,2343 4,2446 55,9889 0,3384 1,6487 0,5063 FABP3 7,8013 2,3535 0,2369 0,1423 0,2671 4,1970 54,6667 0,2696 1,6163 0,4971 FABP4 7,2304 2,0109 0,2521 0,1233 0,2404 3,9851 52,3772 0,2529 1,6360 0,4829 FABP5 8,1123 2,2988 0,2532 0,1468 0,2851 4,4813 58,3174 0,3000 1,6895 0,5174 FABP6 5,9565 3,3366 0,4583 0,0632 0,1808 2,6415 48,5553 0,3255 2,1426 0,5645 FABP7 5,5473 2,6692 0,4534 0,0947 0,1837 3,1861 49,4048 0,2923 2,0610 0,5614 FABP8 4,4863 2,3711 0,2640 0,0749 0,1471 2,9438 76,6367 0,3081 1,9444 0,5692 FABP9 5,4700 1,6269 0,1687 0,1849 0,2361 3,2595 41,6162 0,3454 1,7618 0,8098 FABP10 5,1467 2,4501 0,3852 0,1019 0,1806 2,9225 100,0014 0,2087 1,5901 0,3917 FABV1 17,8012 11,9256 0,1883 0,0863 0,1334 5,6858 139,3871 0,2168 0,0406 0,0237 FABV2 19,9802 11,6990 0,0356 0,0634 0,1677 6,3838 142,7976 0,1904 0,0507 0,0407 FABV3 19,7137 11,5169 0,0719 0,0682 0,1629 6,2421 138,0047 0,2003 FABV4 27,1826 13,8766 0,0626 0,0614 0,2076 5,7080 132,0994 0,1721 0,0438 0,0340 FABV5 28,0983 16,6363 0,2886 0,0504 0,3322 5,5035 103,3607 0,2021 0,0205 0,0004 FABV6 27,8834 16,5100 0,2927 0,0493 0,3376 5,5932 105,1849 0,1580 0,0391 0,0361 FABV7 30,8365 16,3415 0,0397 0,3348 5,7885 109,2101 0,1520 0,1521 0,1065 FABV8 23,0641 14,0384 0,2498 0,0780 0,2347 5,1901 114,2224 0,1768 0,0890 0,0785 FABV9 23,9282 14,1493 0,3385 0,2609 4,3492 93,1204 0,1499 0,1222 0,1270 FABV10 24,0576 14,2780 0,2570 0,0404 0,2471 4,1948 115,2018 0,1632 0,0109

14 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Sanlúcar del Guadiana Ac. Galico Hidroxitirosol Tirosol Ac. Vainillico Ac. Cafeico Vainillina p-Cumarico o-Cumarico Oleuropeina Rutina Luteolina Apigenina FASA1 n.d. 1,1276 0,3376 0,0859 10,6026 61,4191 1,2562 2,4380 0,6278 FASA2 0,9523 0,2907 0,0024 13,0230 53,2172 1,2942 1,5149 0,4127 FASA3 2,4891 0,2017 -0,0109 14,6191 36,1869 1,0676 2,1092 0,4159 FASA4 1,1099 0,2931 0,0936 10,1003 41,0067 1,1413 2,3425 0,5563 FASA5 1,6017 0,2545 0,0509 15,3904 39,5301 0,9824 2,5357 0,6349 FASA6 3,0985 0,2994 0,1710 0,1741 13,2309 43,1402 0,7168 3,4848 0,8090 FASA7 2,4455 0,5721 0,2064 0,1412 5,8982 77,4770 0,8532 1,9255 0,5497 FASA8 2,1488 0,8585 0,2182 0,1597 7,0528 90,4772 0,8587 2,2792 0,6255 FASA9 1,5365 0,4022 0,0282 0,2165 0,1054 4,0590 58,9031 0,8134 2,2255 0,6964 FASA10 1,2435 0,1860 0,0092 7,6754 64,5628 0,9956 1,8841 0,6432 FASA11 1,4579 0,1753 7,8067 66,5445 1,0270 1,7330 0,6176 FASP1 6,4480 1,6746 0,1696 0,0730 10,1958 108,6909 0,3656 FASP2 6,7534 1,7861 0,1669 0,0595 10,2747 107,8246 0,3050 FASP3 8,7324 3,1023 0,1283 0,1538 0,1579 3,2177 54,1519 0,2666 FASP4 11,4083 3,5949 0,0148 0,1199 0,2106 4,1795 44,8215 0,2499 FASP5 8,0050 2,6124 0,1380 0,2265 3,9898 42,4346 0,2409 0,0854 FASP6 5,9891 2,1734 0,1626 0,1368 10,7084 121,6571 0,4010 FASP7 7,2693 2,8937 0,0962 0,1286 0,2093 3,0439 37,8050 0,3233 0,0044 FASP8 9,1745 2,8361 0,1574 0,2166 4,0447 40,5075 0,2226 0,0317

15 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Gibraleón Ac. Galico Hidroxitirosol Tirosol Ac. Vainillico Ac. Cafeico Vainillina p-Cumarico o-Cumarico Oleuropeina Rutina Luteolina Apigenina FAGV1 n.d. 31,1505 18,7196 0,1820 0,0229 0,4421 3,4789 70,5713 0,1588 0,1373 0,1305 FAGV2 19,9987 12,8418 0,0671 0,1267 0,2408 6,2260 111,2875 0,1502 0,0710 0,0435 FAGV3 19,1841 14,9155 0,0275 0,1814 3,2505 75,6667 0,1724 0,0681 0,0626 FAGV4 21,2674 15,9880 0,0056 0,0478 0,2397 2,6034 60,7144 0,1627 0,0105 FAGV5 26,6573 11,5472 0,0257 0,0099 4,3375 86,8393 0,1774 0,1914 0,1057 FAGA1 7,7357 0,7245 0,1929 6,4468 29,0767 0,6413 0,2381 0,0948 FAGA2 5,0443 0,1432 0,1737 6,3589 30,9629 0,5267 0,1379 0,0341 FAGA3 3,6764 0,1244 6,5798 33,2675 0,5146 0,1204 0,0068 FAGA4 3,8173 0,1256 7,1915 37,6101 0,4713 0,4918 0,1163 FAGA5 3,3621 0,1839 8,5108 53,5625 0,5969 0,1896 0,0450 FAGP1 21,9201 4,4034 0,4207 0,0614 0,0329 2,0511 0,1613 0,4297 0,0794 FAGP2 18,0837 5,0648 0,0526 0,5095 0,0339 2,9659 39,5122 0,2752 0,1350 0,0096 FAGP3 15,6805 3,1473 0,1552 0,1200 0,2099 4,8913 48,0837 0,3209 0,0789 FAGP4 13,3643 3,0066 0,3087 0,1044 0,1715 5,5956 47,6279 0,2798 FAGP5 25,5787 3,8523 0,5905 0,1276 0,1952 6,9354 89,8460 0,4979 0,0815 0,0003

16 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes del Distrito de Beja (Alentejo) Ac. Galico Hidroxitirosol Tirosol Ac. Vainillico Ac. Cafeico Vainillina p-Cumarico o-Cumarico Oleuropeina Rutina Luteolina Apigenina FADB1 n.d. 2,9214 0,3665 45,9677 1,0950 0,3368 FADB2 14,3529 9,3649 1,1073 37,8215 1,0879 0,7268 FADB3 10,9613 18,4227 0,0897 0,5257 46,2109 0,8159 0,4983 FADB4 17,3215 11,6895 0,1088 0,6199 37,0246 0,8901 0,5397 FADB5 9,0279 15,2290 0,0062 1,5737 102,4909 0,6306 0,3262 FADB6 3,8511 1,5358 0,0875 0,8353 85,8921 2,3966 1,2218 FADB7 11,4813 22,4462 0,0669 0,2867 58,9930 0,7542 0,2698 FADB8 8,6401 5,2104 0,0942 1,9155 40,0029 1,6286 0,8425 FADB9 14,8945 4,4917 0,0124 81,0853 1,1221 0,5465 FADB10 0,4039 7,0584 1,8691 44,1198 0,8238 0,1184 FADB11 3,2122 2,3253 0,1156 86,3820 2,7409 0,7669 FADB12 6,9046 5,3009 0,2929 0,6483 61,2265 3,2821 1,6589 FADB13 0,8601 3,6951 FADB14 0,7221 6,2224 0,0001 FADB15 5,7820 4,0938 4,5505 0,0212 FADB16 2,2823 4,2150 6,2785 0,0850 FADB17 1,3073 4,3785 5,5350

17 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes del Distrito de Faro (Algarve) Ac. Galico Hidroxitirosol Tirosol Ac. Vainillico Ac. Cafeico Vainillina p-Cumarico o-Cumarico Oleuropeina Rutina Luteolina Apigenina FAAL1 0,04 0,01 5,19 5,33 1,4 14,45 10,75 0,03 27,96 33,62 0,02 FAAL2 n.d. 5,18 1,44 5,67 6,46 0,24 36,5 FAAL3 10,36 3,96 2,6 9,3 13,53 6,68 20,49 1,04 4,34 6,04 FAAL4 0,06 0,35 4,2 2,02 2,95 2,49 4,79 FAAL5 1,33 1,38 0,78 0,38 0,22 3,71 2,61 3,66 FAAL6 1,62 0,48 0,61 0,14 0,53 0,12 0,27 4,06 FAAL7 0,9 0,19 0,05 0,07 0,09 FAAL8 2,63 1 2,11 2,83 2,28 0,85 1,02 1,18 1,47

18 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja
5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja Con el tratamiento estadístico de los resultados se pretende conocer el comportamiento de muestras con diferentes procedencias y variedades en función de su contenido fenólico. Al realizar un Análisis de Componentes Principales (PCA) inicial con todas las muestras, se observa como las procedentes del Distrito de Faro se diferencian de las procedentes del Distrito de Beja y de Huelva de forma significativa, esto puede ser debido a pequeñas modificaciones llevadas a cabo durante el proceso de análisis o bien a que se tratan de aceites de características muy diferentes al resto en cuanto a su contenido fenólico.

19 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja

20 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja
5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja Del mismo modo, el Análisis Canónico (CA) llevado a cabo teniendo en cuenta todos los fenoles corrobora los resultados obtenidos previamente mediante PCA , donde puede observarse claramente como las muestras procedentes del Distrito de Faro se diferencian notablemente del resto.

21 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
5.2. Huelva y Distrito de Beja Con el fin de reducir el número de variables, se dispone a realizar un Análisis Discriminante por pasos el cual determina, que con sólo 6 fenoles de los 12 totales se consigue diferenciar los aceites procedentes de Huelva de los procedentes del Distrito de Beja. Siendo los 3 primeros fenoles los más significativos a la hora de diferenciar las muestras procedentes de Huelva de las de Beja dado su reducido valor del p-level (error).

22 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
5.2. Huelva y Distrito de Beja

23 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
5.2. Huelva y Distrito de Beja En la figura de la derecha puede observarse como las muestras de Huelva se diferencian perfectamente de las procedentes de Beja tan solo teniendo en cuenta los fenoles clasificados anteriormente, debido entre otros aspectos a la ausencia de los mismos en las muestras procedentes del Distrito de Beja en comparación con los aceites procedentes de Huelva, salvo para la Apigenina donde la tendencia es inversa, tal y como puede apreciarse en los gráficos de la izquierda.

24 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.3. Huelva
Para poder diferenciar los aceites procedentes de Huelva en función de la variedad a la que pertenecen (Arbequina, Picual y Verdial), se llevó a cabo un Análisis Discriminante por pasos (SLDA) seguido del correspondiente CA. El Tirosol y la Rutina pueden considerarse los fenoles claves a la hora de clasificar en función de la variedad dado su reducido valor del p-level (error).

25 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
5.3. Huelva El Análisis de Componentes Principales considerando únicamente las variables seleccionadas mediante SLDA (Tirosol, Rutina y Oleuropeina) muestra como las tres variedades se distinguen claramente, siendo la variedad Verdial la más diferenciada del resto, al igual que ocurre en el CA, esto puede ser debido en gran medida a la alta concentración de Tirosol que presenta en comparación con el resto de variedades.

26 Muchas gracias