Cap 8 Control of Gene Expression

Presentación del tema: "Cap 8 Control of Gene Expression"— Transcripción de la presentación:

1 Cap 8 Control of Gene Expression
JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al.

2 Objetivos Discusión de las principales formas de control de expresión genética Comparación de expresión genética en procariotas y eucariotas

3 Expresión Genética Mecanismos y procesos a través de los cuales la información almacenada en el DNA está disponible y es utilizada en la síntesis de mRNA y posteriormente de proteínas. Regulación de expresión diferencial del genoma.

4 08_01_same.genome.jpg En que se parecen y/o se diferencian estas dos células? Mismo genoma Diferente patrón de expresión Diferenciación Expresión diferencial 08_01_same.genome.jpg Dos celulas de un mismo organismo y de un mismo individuo; Tienen el mismo DNA Producen diferentes sets de proteinas Electroforesis en dos dimensiones revela que hay proteinas comunes a todas las celulas y hay proteinas diferentes especializadas para cada celula unicamentes El mismo genoma Diferentes Tamanos Diferentes Funciones Diferenciacion Especializacion por funciones Expresion diferencial del genoma _ Distintos mRNAs y distintas proteinas para distintos tejidos y distintas funciones

5 Diferenciación vs Totipotencialidad
08_02_genetic.instruc.jpg Diferenciación vs Totipotencialidad 08_02_genetic.instruc_Part1.jpg Observaciones Diferentes tipos de celulas en un organismo tienen el mismo tipo de DNA El mismo Genoma Las instrucciones completas para generar un organismo Las celulas en un organismo difieren no porq tengan distinto DNA sino porq lo expresan diferentes Eso da lugar a tejidso organos sistemas etc… Organismos completos Pregunta – el potencial de dirigir el desarrollo completo se pierde con la diferenciacion? Hipotesis - NO porq esta todo el genoma alli Diseno – Poner un nucleo “diferenciado” en una celula no diferenciada y ver q pasa? Xenopus – ovocito uv + microinyeccion de nucleo de celulas de piel – renacuajo Plantas – una celula proveniente de un tejido diferenciado es capaz de dirigir todo el proceso Potencialidad – Toti – pluri- uni Diferenciacion Dedifrenciacion Transdiferenciacion Retrodiferenciacion

6 Diferenciación vs Totipotencialidad
08_02_genetic.instruc_Part2.jpg Las celulas en un organismo difieren no porq tengan distinto DNA sino porq lo expresan diferentes Proteinas de diferenciacion Proteinas housekeeping Celulas diferenciadas aunq especializadas contienen las instrucciones geneticas para dirigir la formacion de un organismo completo Las bases para la clonacion de organisms Expreson genica se estudia, estudiando las proteinas, electroforeis, mas spectro y northern o microarrays Genes: Tejido específicos Housekeeping

7 Gene Expression: Control levels
08_03_control.steps.jpg Etapas de control implica que el proceso de expresion se puede controlar o regular Algunas celulas expresan sus genes en respuesta a senales externas Diferentes celulas responden de forma distinta al mismo estimulo Glucocorticoide higado, tejido adiposo El proceso puede ser regulado en muchos puntos de la ruta q va de DNA  RNA Proteina Control de cuando y como un gen se transcribe el principal control Control de como se procesa si se procesa Control de si es seleccionando ese mRNA para exportar exportan Control al ser seleccionado para ser traducido, enviado a los ribosomas Control al ser seleccionado para degradarlo; luego de usarlo o sin usarlo Control al activar o no inactivar la proteina, secuestrarla y degradarla luego de usarla

8 08_04_gene.reg.prot.jpg Transcripcional: Principal punto de control
Es el principal intermediario Genes on/off Proteínas que se pegan a secuencias reguladoras, otras q no son el promotor Zurco mayor 08_04_gene.reg.prot.jpg El principal punto de control es el 1- Transcripcion si no hay RNA no habran intermediarios Como funcionan los interruptores geneticos – 50 anios atras no se podia pensar q fuera posible prender o apagar gener o q ells funcionaran de esa forma Avances en Ecoli reguladores de transcripcion, proteinas q controlan expresion a nivel de transcripcion punto 1 Proteinas q se pegan a secuencias reguladoreas del DNA – ademas del promotor Cortas en bacterias y largas en eucariotes Trabajan no por si solas sino por proteinas q las reconocen reguladores de transcripcion Ambas cosas forman el switch Las proteinas se unen al zurco mayor, interaccionan cn las bases y separan la doble helice

9 08_05_binding motifs.jpg Homeodominios Zinc fingers Leucine Zipper
08_05_binding motifs.jpg Distintos binding motifs Homeodominio – A Y B - 3 helices alfa la q mas contacto hace es las roja (3) Asparagina con Adenina Homeodominios – 69 aa, descubierto en Drosophila, conservado, reconoce por Helix turn helix - dos helices una se siente en el zurco mayor reconoce secuencia de 6 bp Zinc finger (C) una helice alfa y una placa B unidos por una molecla de zinc Se encuentran en pares unidos al Zurco mayor y la helice alfa toca las bases Zinc fingers – identificada en TFIIIA de RNA pol III y luego en la II - cada dedo tiene 30 aa con par de cisteinas e histidinas conservadas q se unen a un Zinc Steroides como el GCS son zinc fingers pero - son 4 residuos de cisteina - el dedo e sde dos helices - incluyen un dominio para dimerizacion, dosmoleculas funciona como una D) Zipper de Leucina formado por dos helices alfa cada una viene de una proteina disinta Se une al DNA como dimeros, como un pinche de ropa Leucine Zipper

10 DNA recognition structures of some transcription factors
Ejemplos Tabla 15-2 asignada con sus enfermedades Zinc fingers – identificada en TFIIIA de RNA pol III y luego en la II - cada dedo tiene 30 aa con par de cisteinas e histidinas conservadas q se unen a un Zinc Steroides como el GCS son zinc fingers pero - son 4 residuos de cisteina - el dedo e sde dos helices - incluyen un dominio para dimerizacion, dosmoleculas funciona como una Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

11 University of Puerto Rico Intercampus Doctoral Program in Biology
E2- Mechanism of Action Receptores de Esteroides son factores de transcripcion From Geneka Biotechnology

12 08_06_single.promot.jpg Operon de Triptofano
Ejemplo clásico de control y regulación de expresión en base a la necesidad de alimentos (cambios en ambiente) 08_06_single.promot.jpg – Operon de triptofano Los switches de transcripcion permiten a la celula responder a cambios en el ambiente Los mejores ejemplos y mas conocidos son en bacterias y fagos Bact regulan su expresion en base a las fuentes de alimentacion en el ambiente (glucosam fuentes de Carbono) Operon de triptofano – 5 genes para 5 proteinas en un mRNA policistronico todos transcritos a la vez Si no hay triptofano. Se expresan para fabricarlo Si aparece triptofano y entra a la celula; operon se apaga PLT no se expresan los genes Como opera -5 genes para 5 proteinas en un mRNA (policistrónico) -transcripción y traducción simultánea -No triptófano – operón se enciende -Si triptófano – operón se apaga

13 Operon de Triptófano - Como opera?
08_07_repress.protein.jpg Operon de Triptófano - Como opera? Operador: Represor alostérico Triptófano? 08_07_repress.protein.jpg Operador es secuencia en el promotor q si esta libre permite a la pol transcribir Si se pega el regulador de transcripcion a el la pol no se puede pegar al promotor y se apaga Pero q tiene q haber para qel el regulador se pegue y reprima la transcripcion? Varias moleculas de TRIPTOFANO!!! El represor de triptofano es una molecula alosterica Se pega TRP cambia conformacion y se pega… al promotor si no hay triptofano la forma q adopta no lo deja pegarse al operador en el promotor El represor esta siempre presente… se expresa constitutivo a bajo nivel pero inactivo

14 Represores vs Activadores
08_08_activator.prot.jpg Represores vs Activadores 08_08_activator.prot.jpg Represores apagan genes y Activadores los prenden Represor de TRP es una proteina represora cuando esta activo, apaga genes, los reprime Activadores, proteinas activadoras cuando estan aactivas prenden genes Se pegan a la pol y la ayudan a pegarse al promotor … Dependen de q otra molecula los active EJ CAP es un activador dependente de [cAMP] para poderse pegar al DNA Estos genes regulados por CAP son expresados si [cAMP] intracelular aumenta Esto pasa cuando ya no hay glucosa y entonces CAP prende otros genes para metabolizar otras azucares Represor activo: reprime genes - Se pega al promotor Activador activo: activa genes Se pegan a la pol y la estimulan Ambas son alostéricas Ej: CAP – activador - Dependiente de cAMP [cAMP ] aumenta cuando no hay glucosa, para que se metabolicen otra azucares

15 Operón de Lactosa Un activador y un represor controlan el operon de Lactosa Un promotor controlado por dos reguladores de transcripción: Lac operon controlado por; lac represor y CAP activador - Codifica proteinas para importar y metabolizar lactosa En ausencia de glucosa: cAMP aumenta y se ativan los genes regulados por CAP CAP prende los genes para lactosa , pero si esta lactosa presente; sino para q los necesita seria perder esfuerzo - Lac represor los apaga cuando no hay lactosa El operon es expresado cuando se dan dos condiciones: Lactosa presente y glucosa ausente Si no estan LAS DOS, no epera

16 08_09_lac operon.jpg 08_09_lac operon.jpg – Un activador y un represor controlan el operon de Lactosa Un promotor controlado por dos reguladores de transcripcion: Lac operon controlado por lac represor yCAP activador Codifica proteinas para importar digerir lactosa En ausencia de glucosa: cAMP aumenta y se ativan los genes regulados por cap (cAMP) rojo CAP prende los genes para lactosa , pero si esta lactosa presente; sino para q los necesita seria perder esfuerzo Lac represor los apaga cuando no hay lactosa El operon es expresado cuando se dan dos condiciones: Lactosa presente y glucosa ausente

17 Regulación en Eucariotas
- Reguladores de transcripción controlan la expresión a la distancia - Usan activadores y represores pero estos se unen a regiones conocidas como enhancers… aumentaban la expresión dramáticametne - Lo hacen a miles de bp y tanto upstream como dowstream COMO? - El módelo sugiere un loop del DNA trayendo cerca del promotor y del complejo de iniciación la región donde esta el regulador - Activadores y mediadores facilitan el ensamblaje del complejo de iniciación o lo sabotean - Tambien atraen proteínas que modulan estructura de la cromatina afectando la accesibilidad de promotor a los factores y la polimerasa

18 08_13_gene.activation.jpg 08_13_gene.activation.jpg En Eucariotes
Reguladores de transcripcion controlan la expresion a la distancia Usan activadores y represores pero estos se unen a regiones conocidas como enhancers… aumentaban la expresion dramaticametne LO hacen a miles de bp y tanto upstream como dowstream COMO El modelo sugiere un loop del DNA trayendo cerca del promotor y del complejo de iniciacion la region donde sta el regulador Activdores y mediadores facilitan el ensamblaje del complejo de iniciacion o lo sabotean Tambien atraen proteinas que modulan estructura de la cromatina afectando la accesibilidad de promotor a los factores y la poimerasa

19 08_14_chromatin.struc.jpg Promotores en nucleosomas, como los liberamos? 08_14_chromatin.struc.jpg El empaquetamiento de DNA del promotor en los nucleosomas puede afectar la iniciacion de la transcripcion -Hay q tomar en cuenta el empaquetamiento en esto de la expreion genetica Si un nucleosoma esta sobre un promotor va a inhibir la iniciacion de transcripcion Eso es para evitar liqueos de transcripcion pero hay q tener como modificarlo Las activadores recrutan proteinas q modifican la estructura Acetilaciones de a lisinas Deacetilaciones Remodelacion de la cromatina -acetilaciones de lisinas -deacetilaciones -remodelacion

20 Mecanismos moleculares de diferenciación
Procariotas – cambios reguladores son rapidos y no se guardan Eucariotas – cambios son lentos y permanentes para varias generaciones (tejidos multicelulares) Memoria celular – requisito para crear un organimos diferenciado Eucariotas regulan por combinación de proteínas Un grupo de factores determinan la expresión de un gen En otras palabras Un gen puede ser controlado por un conjunto o combinación de factores El resultado será la sumatoria de todos los factores

21 08_15_Reg. proteins.jpg Eucariotas: Proteinas reguladoras, cambios lentos y permanentes: control combinado – varios factores  gen 08_15_Reg. proteins.jpg En procriote los cambios reguladores son rapdiso y no se guardan.. EN eucariotes hay q guardarlos porq los tejidos tienen q seguir haciendo lo mismo por anios.. Memoria celular! Prerequisito para crear un organismo diferenciado Eucariotes regulan genes por comibinacion de proteinas… Un grupo de protenias q trabajan juntos para determinar la expresion de un gen Eucariotes un gen puede ser controlado por una docena de factores algunos activadores otro represores La sumatoria de todos los efectos da el resultado -memoria celular de tejidos -control combinatorial -sumatoria de activadores y represores

22 08_16_anterior_posteri.jpg HOW WE KNOW? 08_16_anterior_posteri.jpg
La polaridad antero posterior dle huevo de drosophila es controlada por moleculas localizadas en cada polo Una peq cantidad del citoplasma se deja escapar de un extremo (anterior) y se reemplaza con un poco de citoplasma del otro polo (posterior) Termina con un huevo doble posterior Se observa la duplicacion de 3 segmentos abdominales en el adulto

23 08_17_4.gene.reg.prot.jpg HOW WE KNOW? 08_17_4.gene.reg.prot.jpg
Hipotesis es que que el patron normal anteroposterior puede estar gobernado por proteinas expresadass en distintos lugares del huevo Tratan huevos para inactivan genes al azar y luego miran q le pasa al embrion; ven anormalidades Identifican varias proteinas y preparan anticuerpos contra estas Expto con anticuerpos detectan distintos factores reguladores demuestran que el citoplasma de un embrion contiene una mezcla de varios factores, cada uno distribuido en una forma o patron unico a lo largo del embrion De esta forma los nucleos dentro de esta celula multinucleada comienza a expresar distintos genes dependiendo del factor que le toca a cada nucleo, o sea q lo activa o inactiva Esto depende de su localizacion en el eje anteroposterior Cada nucleo recibe un bano de un factor, combinacion de estos y cantidades variables lo q determina su destino final Informacion posicional

24 08_18_reporter.gene.jpg HOW WE KNOW? 08_18_reporter.gene.jpg
Eve es un gene q detecta las concentraciones de los distintos factores reguladores a lo largo del embrion Se expresa en 7 franjas a lo largo del eje anteroposterior Para ver como estos factores regulan a Eve se enfocan en la region reguladora del gen (el promotor) Disectan el DNA : la hipotesis es cada region o secuencia reguladora controla la expresion de un gen Enlazan las secuencias individualmente a un gen reportero y estudian la expresion de las bandas relacionandolas a cada secuencia Acoplan en pares en trios y asi determinan cual region regula cual banda Hay 7 modulos reguladores uno para cada banda Aqui cojieron la seccion2 y la pusieron con el gen reportero , se ve q se expreso la banda 2

25 08_19_eve.stripe.2.jpg HOW WE KNOW? 08_19_eve.stripe.2.jpg
Como cada uno de estos modulos dirige la formacion de una banda? Cada moldulo tiene una combinacion de secuencias reguladoras que liga distintsa combinaions de 4 factores de trnascripcion que estan presentes en distints combinaciones en el gradiente del embrion La banda 2 tiene tiene regiones para los 4 factores: Bicoid y Hunchback activan y Kruppel y Giant inihben Las diferencias en concentraciones de estos determinan quien se pega donde en el modulo de Eve 2 Estos dicen donde expresar Eve 2

26 Control combinado: un factor varios genes - HRE
08_20_coord.expressio.jpg 08_20_coord.expressio.jpg GCReceptor, ejemplo de Control coordinado Un solo factor regulador puede coordinar la expresion de varios genes diferentes En procariotes la expresion de varias proteinsa se coordina en un operon EN eucariotes los genes estan muy distantes unos de otros y los genes se regulan y controlan individualmente Y la regulacion es por un comite de factores Como se hace para rapidamente activar todos esos genes? Con un solo factor q puede se necesario para activarlos a todos Es como q distintos genes respondan al mismo factor de transcripcion EJ Glucocorticoide y su Hormone Response Elements Todos los genes a activarse comparten una secuencia q el mismo factor reconoce La llegada de la hormona activa al receptro y este a su vez activa los 3 factores reguladores y los 3 genes con una sola senal

27 08_21_Fibroblasts.jpg Control combinado puede generar distintos tipos de celulas Fibroblastos: -convertidos miocitos por MyoD -provocando distintas diferenciaciones -mioblasto + mioblasto = miocito -actina, miosina, canales de Ca+2 y Na+… se expresan por MyoD en mioblastos fusionados -fibroblastos + MyoD =? MyoD: Regulador de transcripción “muscle-specific”… meaning? Fibroblastos son inducidos a mioblastos por expresión artificial de MyoD y este induce expresión diferencial del genoma para músculo Fibroblastos y mioblastos salen del mismo origen embrionario Otras celulas no se diferencian en mio.. 08_21_Fibroblasts.jpg – Fibroblastos convertisos a miocitos por un solo factor regulador de transcripcion El control combinatorial puede generar distintas celulas Provocado distintas diferenciaciones Prendiendo o apagando muchos genes con una sola proteina Celula muscular estriada: larga por fusion de mioblastos Miocitos producen unas proteinas caracterisiticas: miosina y actin Se da por reguladores de transcripcion claves Que se expresan en celulas potenciales Y los lleva a ser mioitos LO expresan artificial en fibroblastos (MyoD) y termina como miocitos Porque al ser de la misma linea embrionica tienen otros factores reguladores necesarios comunes En otras celulas no se puede

28 08_22_cell.types.jpg Distintas combinaciones de factores producen distintas celulas. - Factores reguladores distintos se acumulan 08_22_cell.types.jpg Como la acumulacion de distintos factores reguladores de transcripcion llevana a genere distintoso tipos de celulas? Fig 8.19 Por control combinatorial y secuencias reguladoras compartidas un grupo peq de reguladores de transcripcion pueden controlar La expresionde muchos mas genes La decision de hacer un nuevo regulador es un numero en cada division celular Al repetir esto permite crear 8 tipos de celulas salir usando solo 3 diferentes reguladores de transcrpcion combinados o solos Cada celula es distinta porq expresa distintos genes segun la conmbina cion de factores q expresan

29 08_23_cell.memory.jpg Como se hereda la diferenciacion; Memoria celular 08_23_cell.memory.jpg Como se pasa la diferenciacion a celulas hijas? Creando memoria en celulas hijas Un feedback positivo puede crear memoria Prote A es un regulador de transcripcion que actica su propia transcripcion Todos los descencientes del la celula original recordaran que la celula original Experimento una senal que inicio la produccion de una protrina Patron de condensación heredado de una celula a otra – Cuerpo de Barr Metiltransferasas reconocen patron en un DNA y cuando se replican lo copian en la nueva Feedback ____________ Propagacion de una patron de condensacion de la cromatina Metilación del DNA (Citosinas) - metiltransferasas

30 Reguladores de transcripción dirigen organogenesis!
08_25_eye.on.leg.jpg Reguladores de transcripción dirigen organogenesis! 08_25_eye.on.leg.jpg La formación de un organo completo puede ser activada por un solo regulador transcripcional. Ejemplo de esto es el desarrollo del ojo en Drosophila, raton y jhumano Ey es un regulador de transcripcion (Pax 6) para el desarrollo del ojo Cuando se expresa en celulas apropiadas dirige no solo la formacion de un tipo de celula sino de un organo completo’ Es expresado en celulas q deben formar patas Como lo hace solo se sabe que controla la expresion de muchos genes uniendose a secuencis reguladoras Algunas de estas son para otras reguladoras que regulan a otras proteinas Feedback positivo asegura q sigan saliendo celulas del mismo tipo. Asignar RNA I… La formacion de un organo completo activada por un solo regulador transcripcional (Ey/Pax): Cascada de factores y feedback + en Ey

31 Controles Post-transcripcionales: Riboswitches
Riboswitches – secuencias de RNA q cambian conformacion al unirse a metabolitos y moleculas peq y asi regulan expresion - tipicos de bacterias, responden a metabolitos y activan genes segun se necesitan - económicos por que no necesitan proteinas Otras oportunidades de control Alternative splicing Aqui vemos otros – tipos de mRNAs q pueden regulas su propia transcripcion t traduccion Riboswitch de guanina – La misma guanina apaga la sintesis Pueden regular traduccion tambien

32 Controles Post-transcripcionales:UTRs
Una vez el mRNA existe un punto de control importante es la iniciacion de la traduccion Procariotas: tienen una RBS upstream el AUG, donde la subU pequena se aparea y acomoda el AUG para iniciar Bloquear esta region con Represores es una forma de control Eucariotas: tienen el Cap en el 5’ que guia al ribosoma hasta el primer AUG. Represores se asocian al 5’UTR bloqueando el paso del ribosoma hacia el AUG Una vez el mRNA esta, un punto de control es el control de la iniciacion de la traduccion

33 Controles Post-transcripcionales: microRNAs
Una vez el mRNA existe un punto de control importante es la iniciacion de la traduccion Procariotas: tienen una RBS upstream el AUG, donde la subU pequena se aparea y acomoda el AUG para iniciar Bloquear esta region con Represores es una forma de control Eucariotas: tienen el Cap en el 5’ que guia al ribosoma hasta el primer AUG. Represores se asocian al 5’UTR bloqueando el paso del ribosoma hacia el AUG Una vez el mRNA esta, un punto de control es el control de la iniciacion de la traduccion -

34 Controles Post-transcripcionales:micro RNAs
-miRNA – tipo de RNA no codificante en plantas y animales - humanos mas de 400 miRNAs - regulan mas de 1/3 de los genes estructurales - por complementaridad, regulan estabilidad y traducción - precursor, procesado a miRNA - asociado a proteinas forma RNA induced silencing complex -RISC, se mueven por el citoplasma buscando sus mRNA complementarios, se les pega en los UTRs y propicia su degradacion Una vez el mRNA esta, un punto de control es el control de la iniciacion de la traduccion -

35 miRNAs: pre-Drosha-Dicer-RISC

36 Controles Post-transcripcionales: RNAi
-RNAi – para destruccion de RNAs DS ajenos - son las mismas que llevan miRNAs sirven de sistema inmmune - RNAs DS? = viruses y retrotansposones - Cuando estos DS RNA entran DICER los reconoce (nucleasa) - los degrada en fragmentos de 23 ncltds (siRNAs) - estos se incorporan a RISC que degrada una de las strands - RISC busca el mRNA con la otra cadena para degradarlo - conservados desde hongos hasta invertebrados, plantas Aplicacion: - usarlo para apagar genes y ver efectos y determinar funcion - usarla para apagar genes defectuosos o fuera de control Una vez el mRNA esta, un punto de control es el control de la iniciacion de la traduccion -

37 siRNA

38 Ambas rutas: Micro RNA para degradar mRNAs o regular traduccion siRNA para defender al organismo de DS RNA ajenos

39 RNAi Therapy