Alteraciones citoesqueletales y nucleares en células tumorales de pulmón: un estudio de microscopio confocal Renata Manelli-Oliveira, Gláucia Maria Machado-Santelli.

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1 Alteraciones citoesqueletales y nucleares en células tumorales de pulmón: un estudio de microscopio confocal Renata Manelli-Oliveira, Gláucia Maria Machado-Santelli

2 Objetivo ➣ Caracterizar los filamentos del citoesqueleto
➣ Analizar si existe una asociación entre alteraciones nucleares y en el citoesqueleto en células de pulmones humanos con carcinoma

3 Introducción Citoesqueleto: Tres tipos de filamentos
Juegan un rol importante en la organización del núcleo durante la mitosis. Filamentos intermedios Microfilamentos de actina Microtúbulos

4 Vimentina: Filamento intermedio
Introducción Vimentina: Filamento intermedio Se expresa en células mesenquimáticas, como fibroblastos. Función asociada a morfología nuclear y membrana nuclear en mitosis: sin vimentina o con una forma mutada el núcleo presenta deformaciones no se ven alteraciones citoplasmáticas en estas células La expresión de vimentina así como la organización de los filamentos de vimentina son factores importantes en la morfología del núcleo.

5 Introducción Coexpresión de vimentina
La queratina en ratones y humanos es crucial para mantener la integridad y las conexiones requeridas para distintos tejidos epiteliales. Coexpresión de vimentina y queratina asociada a morfología migratoria, presente en células tumorales y relacionada con el potencial de desarrollar metástasis.

6 Introducción Laminas Filamento intermedio que en la interfase interactúa con la cromatina y la membrana interna nuclear (MIN) Asociadas a la ruptura de la membrana nuclear durante la mitosis: Lamina A Lamina B Disociada pero en asociada a la proteína p58 y se reensambla al final de la mitosis Disociada completamente de la MIN

7 Introducción Microtúbulos y microfilamentos de actina
Implicados en la reestructuración de la célula durante la mitosis Estudiados como target de drogas antitumorales: Si se inhibe su polimerización (ej. colchicina) se afecta la proliferación de las células.

8 Materiales y métodos Cultivos celulares:
Línea HK1: células humanas de carcinoma de pulmón (realizada In vitro de una metástasis cervical). Línea HK2: células de un tumor inducido en ratones atímicos “nude” (derivadas de las HK1). A549: línea celular de carcinoma de pulmón. BRL3A: células epiteliales normales de hígado de ratón (control).

9 Materiales y métodos Inmunofluorescencia (análisis del citoesqueleto)
Líneas celulares: HK2, A549, BRL3A. Anticuerpo primario: α-tubulina, vimentin, laminB, cytokeratin peptide 8. Anticuerpo secundario: anti IgG-FITC (raton), anti IgG-FITC (cabra). Núcleo : SYTOX green, TOTO1. Filamentos de Actina: phalloidin-TritC.

10 Materiales y métodos Análisis por microscopía confocal:
El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores.

11 Materiales y métodos Análisis por microscopía confocal:

12 Materiales y métodos Análisis por microscopía confocal: Ventajas:
Permite una mejor resolución de la imagen debido a que elimina la señal de fluorescencia que se encuentra fuera de foco, que disminuye el contraste de la muestra. Se obtienen distintas secciones de la muestra de forma no destructiva. Análisis tridimensional, cuantificación, distribución de fluorescencia, análisis volumétrico de la colocalización, etc.

13 Materiales y métodos Alteraciones nucleares:
➣ Alteraciones en el micronúcleo Estructura formada por cromatina dentro de una envoltura nuclear, siendo ésta más pequeña que el núcleo principal. Se observan como protuberancias bien definidas sobre la superficie nuclear ➣ Alteraciones nucleares incipientes

14 RESULTADOS

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23 Discusión ➣ El plateau de la curva de crecimiento sugiere que las células HK2 mantienen una densidad de saturación, al igual que las células normales a pesar de la presencia de células gigantes. ➣ HK2 y A549 no muestran una fase típica en su plateau. ➣Los filamentos intermedios no son confiables para identificar células tumorales y distintos tipos celulares en un diagnóstico ya que en ellas se pueden coexpresar dos tipos de filamentos. ➣ En células HK2 la actina mostró un patrón de fibras cortas agregadas en el citoplasma, consistente con una morfología celular irregular en células tumorales y con alteraciones en la movilidad celular. Las alteraciones observadas en el núcleo no estan asociadas a las anomalías en la distribución de los filamentos del citoesqueleto.

24 Discusión ➣El patrón de distribución de filamentos de vimentina en este estudio concuerda con otros observados en trabajos previos en cultivos de células endoteliales. ➣Las fibras de stress, características de este tipo de filamentos, se vieron en las dos líneas estudiadas y BRL3A (control) presentó más que las líneas tumorales. ➣Organización del tipo de actina fue más evidente en HK2, siendo consistente con una morfología celular más irregular. Cómo este patrón se encontró en células tumorales se sugiere que la transformación produce alteraciones en estos filamentos y podrían estar asociados a la movilidad celular. ➣La organización espacial de las fibras de stress en A549 fue más similar a las de BRL3A que a las de células normales de hígado de rata.

25 Discusión ➣En las células gigantes de HK2 los filamentos son más evidentes y presentan patrones radiales. Estos patrones se encontraron al marcar filamentos de tubulina a concentraciones altas y bajas de calcio. ➣La presencia de lámina B, en este y otros estudios, resultó indicadora de la integridad de la envoltura nuclear. La concentración de calcio en el medio de cultivo afectaría la organización de los microtúbulos en células no transformadas. Podría utilizarse para la clasificación de alteraciones nucleares si involucran la totalidad de la membrana nuclear, como se vió con HK2 y A549.

26 El citoesqueleto en HK2 está alterado en comparación a A549
Resumiendo ➣El estudio en las líneas HK2 y A549 permitió caracterizar el patrón de organización de los filamentos del citoesqueleto. El citoesqueleto en HK2 está alterado en comparación a A549 ➣Las alteraciones micronucleares y nucleares no se pudieron asociar a las del citoesqueleto. ➣La distribución de los patrones de los filamentos del citoesqueleto citoplasmático fue similar para células con o sin alteraciones nucleares. ➣Se verificó la coexpresión de vimentina y citoqueratina 8 que sucede en diversas células tumorales. Estas caracterizaciones son de importancia para estudios futuros en particular en estudios sobre la acción de drogas.