Leticia Rayas González

Presentación del tema: "Leticia Rayas González"— Transcripción de la presentación:

1 Leticia Rayas González
La replicación del DNA requiere a la proteína Plx1 bajo condiciones de estrés. Kristina Trenz, Alessia Errico y Vincenzo Costanzo Leticia Rayas González

2 Plx1 y condiciones de estrés
Plx1 es una cinasa apagada es el ortólogo de plk1 Inducción de Afidicolina (APH) de la horquillas de (inhibe la replicación DNA replicación polimerasa II ) estancadas Etoposido (se une a la enzima topoisomerasa II. Esto lleva a la interrupción de la replicación y la transcripción del ADN. Reducción de complejos Mcm de unión a ADN. Plk1 se requiere para el progreso de la mitosis, se expresa a través del ciclo celular aunque su función durante la fase S es desconocida.

3 Plk1 Se expresa a través del ciclo celular pero su función durante la fase S es desconocida. Se une a la cromatina y suprime el puesto de control dependiente de ATM / ATR de la interfase S que inhibe la activación del origen. Esto permite que Cdc45 desreprima el inicio de la replicación del ADN. La activación del punto de control aumenta la unión de Plx1 al complejo Mcm a través de su dominio caja Polo. El reclutamiento de Plx1 a cromatina es independiente de los mediadores del puesto de control Tipin y Claspina. El reclutamiento de Plx1 a cromatina y la recuperación de la replicación del ADN bajo estrés requieren la fosforilación de la serina 92 de la proteína Mcm2 dependiente de ATR. La depleción de Plx1 conduce a la acumulación de roturas cromosómicas que se previenen mediante la adición de Plx1 recombinante. Estos datos sugieren que Plx1 promueve la estabilidad del genoma mediante el control de la replicación del ADN en condiciones de estrés.

4 Complejo Mcm Complejo Mcm
El complejo Mcm actúa como helicasa promoviendo la replicación.  En la fase G1, la Cdk (ciclina) promueve la adición de Cdc6 para reclutar a Mcm, formando un complejo prerreplicativo. Al inicio de la fase S, la Cdk-S produce la disociación de Cdc6 y su proteólisis, exportando a Mcm al citosol. El complejo de proteínas Mcm o de mantenimiento minicromosomal, forma el complejo prerreplicativo en cooperación con Cdc6. El inicio de la replicación requiere la activación mediada por Cdk2 y Cdc7 para relajar al ADN (Nougarede et al. 2000, Coleman et al. 1996, Takisawa et al. 2000 and references therein.)

5 Punto de control del ciclo celular en respuesta al daño
ATM y ATR fosforilan componentes de la red, directamente (rojo 'P') o a través de cinasas CHK2 y CHK1 (negro 'P'). ATM / ATR y CHK2/CHK1 también afectan la reparación del ADN, la transcripción, el ensamblaje de la cromatina y la muerte celular.

6 Proteína Plx1 y la replicación del ADN
Western blot ¿Se requiere Plx1 para la replicación del ADN ? B: Replicación (120 Min.) La depleción de Plx1 en interfase no afecta la replicación del ADN. ¿Se requiere Plx1 en condiciones de estrés? F: Plx1 activa no inhibe la replicación del ADN , en cambio la depleción de Plx1 sí En gel de agarosa

7 Controles A: Depletando Plx1 con anticuerpos.
Suplementando con Plx1 recombinante. (2000 núcleos/µl) C: Limitando el número de orígenes de replicación D: Extractos suplementados con alto # de núcleos y dosis altas de geminina (GEM):No afectan la replicación. E: En la replicación con estrés inducido se fosforila Chk1, activando el punto de control dependiente de ATM/ATR En A) se muestra que la proteína Plx1 está depletada En C) Se observa la depleción del complejo Mcm con geminina En D) Se observa que la geminina no afecta la replicación genómica En E) se observa que en presencia de horquillas de replicación estancadas se activa, por fosforilación, el punto de control Chk1 dependiente de ATM/ATR.

8 ¿La unión de Plx1 a cromatina mejora en presencia de horquillas de replicación estancadas?
La unión Plx1/ Mcm7 cargado sobre cromatina se incrementó arriba de 4 veces en presencia de APH en comparación con el control.  ¿Cómo lo determinaron? Comparando la unión de Plx1 y de Mcm7 a cromatina en presencia de APH y GEM: (A) En presencia de bajos niveles de DNA unido a complejos Mcm. Con bajas cantidades de APH se observó un efecto similar al control (B) Cuantificaron la unión de Plx1 a cromatina y a Mcm7  en presencia de APH (etapas tempranas de la replicación) A) Sugiriendo que la inducción de la unión de Plx1 fue hecha por la presencia de horquillas estancadas. B) Western blot con anticuerpos secundarios (tintes infrarrojos)

9 Puntos de control sensibles a cafeína
Western blot A) Probar si los efectos de Plx1 sobre el DNA eran mediados por puntos de control sensibles a cafeína* durante la interfase S La cafeína podría restaurar la capacidad de la replicación del DNA en ausencia de Plx1 y en presencia de APH o GEM Lo que sugiere que Plx1 suprime el punto de control de la interfase S. La activación de los complejos MCM2-7 es regulada por sensibilidad a cafeína , puntos de control dependiente de ATM y ATR. Este punto de control modula la actividad cinasa Cdk2 y Cdc7 regulando el inicio de la replicación durante el ciclo celular no perturbado e interrumpiendo la replicación del ADN en presencia de daño en el ADN o de horquillas de replicación estancadas

10 Regulación del disparo de origen
D) Se sugiere que Plx1 regula el disparo de origen al disminuir los niveles de fosforilación de Plx1. D)Suplementando los extractos control con Plx1 recombinante Simulando horquillas de replicación estancadas: Aumenta tanto chk1 como p-Chk1 en los controles y disminuye p-chk1 en los extractos Plx1 depletados y suplementados Mientras que Chk1 aumenta bajo condiciones de estrés en dichos extractos

11 Controles B) Midieron los efectos de Plx1 sobre la señalización de Chk1, blanco del punto de control de S sensible a cafeína C) Midieron el estado de activación de Chk1 en condiciones de estrés. B) Midieron los efectos de Plx1 sobre la señalización de Chk1, blanco del punto de control de S sensible a cafeína Los pApT imitan de forma incompleta la replicación del ADN e inducen la fosforilación de Chk1, que mejora con la depleción de Plx1. C) Estado de activación de Chk1 Con adición de APH: Se incrementa p-Chk1 tanto en los controles como en Plx1 depletados Incrementa la unión de Plx1 a cromatina con adición de APH D)Suplementando los extractos control con Plx1 recombinante Simulando horquillas de replicación estancadas: Aumenta tanto chk1 como p-Chk1 en los controles y disminuye p-chk1 en los extractos Plx1 depletados y suplementados Mientras que Chk1 aumenta bajo condiciones de estrés en los extractos depletados y suplementados con Plx1 recombinante. D) Estos resultados indican que Plx1 suprime el punto de control de la interfase S sensible a cafeína que regula el disparo de origen.

12 Arresto de la replicación, monitoreo de la unión de Mcm y Cdc45 a cromatina
A) Para entender el mecanismo molecular del arresto de la replicación se monitoreó la unión a cromatina de los complejos Mcm y Cdc45 Para verificar si el daño a Cdc45 reprime la actividad Cdk2 B) Medición de la actividad nuclear por monitoreo de la incorporación de 32P en la histona H1 después de inmunoprecipitación nuclear de Cdk2 con anticuerpos A) Se observa que en condiciones de estrés se ve afectada la unión de Cdc45 a cromatina Para verificar si el daño a la carga de Cdc45 reprime la actividad Cdk2, se midió la actividad Cdk2 nuclear en presencia y ausencia de Plx1 con daño a la replicación del ADN. B) El tratamiento con cafeína restaura la actividad de Cdk2 en extractos con depleción de Plx1 y normales

13 Reclutamiento de Plx1 a la cromatina por Claspina al inicio de la replicación (estrés).
Plx1 fosforila a Claspina, un mediador de la activación de Chk1 induciendo su liberación de la cromatina y promoviendo la adaptación al punto de control que retrasa el comienzo de la mitosis. Probar si la Claspina interviene en el reclutamiento de Plx1 a cromatina. (B) La acumulación de Plx1 en la cromatina inducida por horquillas de replicación estancadas no se afecta por la ausencia de Claspina  Controles: (A) Depleción de Tipin La unión de claspina a cromatina requiere de Tipin por lo que se usó la depleción de tipin como control.

14 Interacción de Plx1 con Mcm durante la fase S
(C) Interacción de Plx1 con Mcm para identificar el mecanismo de reclutamiento de Plx1 a cromatina F) Plx1 es incapaz de unirse a cromatina en extractos depletados del complejo Mcm lo que sugiere que Mcm es el mayor sitio de unión de Plx1 a cromatina durante la fase S. C) pApT incrementa la unión de Plx1 y Mcm7 a cromatina Se observa que co-precipitan juntos al precipitarlos con anticuerpos

15 Importancia de Mcm para la función de Plx1
D) Identificación de la región de Plx1 que se une a Mcm E)¿La unión de la caja Polo a proteínas Mcm se incrementa con la activación del punto de control? Sí y se inhibe con cafeína. Mcm2, Mcm4, Mcm6 y Mcm7 (D) Control SOLO SI ME PREGUNTAN: para identificar las secuencias de interacción de proteínas GST unido a proteínas truncadas con un dominio caja Polo que interactúa c/proteínas fosforiladas (contiene un fragmento derivado de Plk1). Se incubó con extractos de huevo. Se usó un péptido de alta afinidad y se subjectó a una matriz asistida por láser (MALDITOF)

16 Requerimiento de fosforilación serina 92 de Mcm2 para la función de Plx1
Mcm2 es fosforilada sobre la serina 92 por ATM/ATR y su fosforilación puede estar inducida por APH o etoposido Para Probar si la fosforilación de esta serina tiene que ver en el papel del reclutamiento de Plx1 a Cromatina y en la supresión del punto de control mediado por Plx1, se produjo un Mcm2 recombinante B) ¿Plx1 recombinante restaura la replicación de DNA bajo condiciones de estrés con Mcm2-WT o con Mcm2 recombinante? Sustitución de serina por alanina Se observa que la unión de plx1 a cromatina no se afecta en presencia de la proteína Mcm2 tipo salvaje mientras que no hay unión de Plx1 a cromatina en la recombinante y como la serina de Mcm2 recombinante se sustituyó por alanina, se sugiere que la fosforilación de la serina 92 es importante para la unión de Plx1 a cromatina. Plx1 restaura la replicación con Mcm2-WT lo que sugiere que durante la replicación del DNA bajo condiciones de estrés, la fosforilación de Mcm2 mediada por ATR promueve el reclutamiento de Plx1 a la cromatina, lo que libera el bloqueo sobre el disparo de origen impuesto por el punto de control de la fase S. La unión de Plx1 a Mcm se incrementa por la activación del punto de control, lo que sugiere que modificaciones postranscripcionales de Mcm inducidas por activación del DNA dañado podría responder a un aumento de afinidad de Plx1 por Mcm

17 Plx1 previene el rompimiento cromosomal durante la replicación del DNA
¿La ausencia de Plx1 conduce a la pérdida de la integridad del genoma? Se midió el incremento de rompimientos cromosomales en ausencia de Plx1 reduciendo los niveles de unión de Mcm a DNA Las figuras muestran un incremento en el rompimiento de la doble cadena durante la replicación del DNA con bajos niveles de Mcm con la depleción de Plx1 Los rompimientos se previnieron por suplementación de Plx1 recombinante

18 Activación del origen de replicación durante la fase S
Durante la fase S, la activación del origen está regulada a través de un punto de control dependiente de ATM/ATR los datos indican que Plx1 se une a cromatina en presencia de horquillas de replicación estancadas induciendo la supresión del punto de control. Plx1 se une al complejo Mcm activando el origen de replicación por fosforilación en la serina 92 de Mcm2 mediada por ATM/ATR. Este mecanismo promueve la desrepresión de orígenes de replicación suplementarios. Tras la activación prolongada, Plx1 interactúa con Claspina (fosforilación de la Treonina 906) promoviendo la inactivación de la Claspina y la liberación de la cromatina. La inactivación de la Claspina restringe la actividad Chk1 y promueve la recuperación del la replicación del DNA.

19 Gracias