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Estabilidad, pérdidas y generación de alcohol etílico en muestras de sangre postmortem Dra. Leda Giannuzzi Cátedra de Toxicología y Química legal Facultad.

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1 Estabilidad, pérdidas y generación de alcohol etílico en muestras de sangre postmortem Dra. Leda Giannuzzi Cátedra de Toxicología y Química legal Facultad de Ciencias Exactas, UNLP

2 Antecedentes Los trabajos sobre pérdidas de etanol por fenómenos putrefactivos son controvertidos. Coloccia y Argeri (1969) publicaron una experiencia donde observaron pérdidas totales de alcohol a los 15 días posteriores a la toma de muestra con una tasa diaria del 6%. No se mencionan datos sobre el estado del recipiente o muestra sanguínea en el momento de recepción y posterior resguardo como ser existencia de cámara de aire en el recipiente.

3 Otros señalan que las pérdidas de etanol no son relevantes durante su almacenamiento si las muestras son convenientemente extraídas y colocadas en recipientes adecuados y bien sellados. Parson 2002, Sreerama y Hardin, 2003, Ferrari, 2003

4 El uso de preservantes como el fluoruro de sodio en sangre de individuos vivos no mejora mucho los resultados, más aún si la muestra fue tomada con jeringa estéril y mantenida a bajas temperaturas. En estas condiciones la sangre de personas vivas puede analizarse aún después de dos semanas sin variaciones apreciables respecto de la alcoholemia que se hubiera obtenido en el primer día. Winek y Paul, 1989.

5 entera Otros estudios en muestras de sangre entera y suero mantenidas por varias semanas a diferentes temperaturas, indicaron que las muestras resguardadas a mayor temperatura, mostraban pérdidas significativas recién a partir de treinta días (Winek, 1996)

6 La pérdida de alcohol posteriores al óbito y a la toma de muestra pueden inducir a conclusiones erróneas en los casos forenses analizados.

7 Producción de etanol post-mortem (O´Neal y Poklis, 1996) Producción etanol post mortem (100 especies) in vivo e in –vitro. Candida albicans (boca y piel) Glucosa, lactato, manitol, gal, mal, suc, lac Hongos: Mucor (materia orgánica y suelos) Productos volátiles producidos por fenómenos post mortales: n-propanol, butanol, feniletanol.

8 45 muestras de sangre y tejidos obtenidas de accidentes fatales en aviones el 95% de ellas contenían bacterias entéricas capaces de producir etanol (ampliación rDNA)

9 NaF 2 estudios concluyen que NaF no es efectivo en prevenir la formación etanol en sangre de origen microbiano con alta concentración de Candida albicans. Bleme and Lakatua, 1973, Am J. Clin. Pathol., 700. Chang, Kollman, 1989, J. Forensic Sci. 105.

10 Efecto de la temperatura y NaF sobre la producción de etanol en tejidos Lewis, et. al, 2004, Forensic Sci. Intern. 17 Rinón y Músculo víctimas accidente aviación T= 4 y 25ºC Con y sin 1% NaF t- Butanol (standard interno)

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12 Variación de Etanol en músculo (caso 9) durante el almacenamiento a 4 y 25ºC, con y sin NaF sin

13 1. Acetaldehido * 2. Metanol 3. Etanol 4 Acetona * 5. iso-propanol* 6. t- butanol 7. n-propanol* 8. sec-butanol* 9. iso-butanol * 10. n-butanol *sugiere posible formación etanol por bacterias

14 Se observa formación de etanol a 4 y 25°C en tejidos (rinón, músculo) sin NaF la velocidad de formación etanol fue menor a bajas temperatura, pero con el tiempo la producción de etanol en las muestras almacenadas a refrigeración son comparables a las de mayor temperatura. La formación de etanol es virtualmente eliminado con 1% de NaF a 4 o 25ºC. Se observa la formación de compuestos volátiles acetaldehido, n-propanol, sec-butanol, isopropanol, acetona, isobutanol.

15 Comparación en la concentración de etanol en sangre de cavidad cardiaca derecha, izquierda y periférica (30 casos) Comparación en la concentración de etanol en sangre de cavidad cardiaca derecha, izquierda y periférica (30 casos) Grado de putrefacción, daño abdominal, regurgitación contenido gástrico en vías aéreas. Grado de putrefacción, daño abdominal, regurgitación contenido gástrico en vías aéreas. Pilissier Alicot et. al, 2005, Forensic Sci. International. Pilissier Alicot et. al, 2005, Forensic Sci. International.

16 Caso C Der C IzqPerif.Gást.BilisOrinaHVAutopsia Sobredosis Ahogo Sobredosis Regurgitacion Regurgitacion Etanol (g/L)

17 Caso C Der C IzqPerif.Gást.Bilis Orin a HVAutopsia Regurgitación Regurgitación Regurgitaciín

18 Caso C Der C IzqPerif.Gást.BilisOrinaHVAutopsia Fuego ahorcamiento Ahogo Regurgitacion regurgitación

19 Concentración de etanol en sangre cardíaca izquierda es significativamente mayor que en el lado derecho o sobre sangre periférica. La diferencia en concentración no correlacionó con el grado de putrefacción, pero correlaciona con etanol en contenido gástrico. La mayor diferencia se observa en sujetos con alta concentración en contenido gástrico y regurgitación (7, 8, 11, 12, 26 y 27). Producción endógena de etanol (izquierdo) poco probable debido: haber ausencia de propanol y etanol en humor vítreo es similar al obtenido en la cavidad derecho y sangre periférica. Se acepta que la producción endógena generalmente no excede 0.3g/L si fue correctamente almacenada.

20 En casos 22, 23, 25 mayor contenido de etanol en sangre cardíaca derecha que el izquierdo observandose también alto grado putrefacción y presencia de n- propanol debido a glucogenolisis hepática que libera glucosa en la cavidad derecha vía vena hepática y la vena cava inferior. Redistribución del etanol desde el estomago 2 mecanismos: a) gradiente de concentración desde estómago al corazón. Este fenómeno es fácil de entender por la posición anatómica del estómago y la parte izquierda del corazón b) redistribución por vía pulmonar si el contenido gástrico es aspirado en la vía respiratoria. Redistribución vía vena pulmonar hacia la parte izquierda del corazón.

21 Casos en que la concentración de etanol en sangre periférica fue mayor que en corazón izquierdo y derecho (10, 25, 30) La autopsia revela mecanismos de resucitación sin éxito sangre cardíaca derecha es menos afectada por la distribución debido a 1) la sangre de este compartimiento no está directamente en contacto con el estómago 2) si es aspirado el contenido gástrico en las vías aéreas, la difusión principalmente hacia la vena pulmonar y hacia la parte izquierda del corazón. Los resultados presentan considerable valor práctico sugieren que es preferible sangre cardíaca del lado derecho mas que el izquierdo con el objeto de limitar tanto como sea posible la redistribución en particular si no hay sangre periférica.

22 Humor Vítreo García Fernandez (1994) analizaron 30 muestras de humor vítreo García Fernandez (1994) analizaron 30 muestras de humor vítreo En doce se obtuvo correlación de la concentración de etanol en HV repecto sangre En doce se obtuvo correlación de la concentración de etanol en HV repecto sangre [etanol]/[etanol] [etanol] sangre /[etanol] humor vítreo = o invertirse HV inmune a contaminación bacteriana o a transformavciones post-mortem

23 Cinética de Degradación de Etanol en muestras de sangre Forenses

24 Estudiar la evolución del etanol en sangre en función del tiempo y evaluar fenómenos físicos en los recipientes donde son contenidos (cámara de aire) y la temperatura de conservación. Analizar la influencia de compuestos originados en la sangre por descomposición de sustancias orgánicas sobre la concentración de alcohol, durante el almacenamiento de las muestras sanguíneas. Racionalizar a través de un modelo teórico cinético la estimación de pérdidas en función de la cámara de aire del recipiente y la temperatura. Objetivos

25 2. Materiales y métodos Determinación de etanol en sangre individuos postmortem. Espacio-cabeza 1 ml de sangre entera previamente homogeneizada. Análisis por Cromatografía Gaseoso-FID: columna de acero inoxidable (2 m de longitud, 3 mm de diámetro interno) empacada con 0.3% Carbowax 1500-graphapack 60/80, isotérmica 100ºC. Temperatura inicial 35°C, 1 minuto y 10°C/min de gradiente hasta 100°C temperatura final; siendo la temperatura de inyección y detector de 150°C. Diseño factorial de los ensayos de variación del contenido de etanol en muestras de sangre sometidas a diversas condiciones de preservación.

26 %CA: 0, 5, 20, 35 y 65% T almacenamiento: 20ºC, 4ºC y –10ºC Diseño factorial: (5 x 3), total: 15 condiciones de ensayo. Estudio de la cinética de degradación de etanol a tiempos: 0, 3, 7, 15 y 30 días. Alcoholemia = 0.5 y 4.30 g/L. Sangre entera sin preservador Se estudió la generación de sustancia de putrefacción determinadas por la relación de áreas: señal previa al Standard interno (amina de putrefacción) y estándar interno: Isopropanol en las muestras de sangre entera. Muestra NaF (5%)Cámara de aire % Cantidad de alcohol agregado (g/L) 1Si No Si No No50.0

27 3. Controversia entre informes publicados Coloccia y Argeri (1969): Pérdidas a tasa constante 6% y pérdida total en 17 días. Charles Winek (1996): Aún a altas Temperaturas las pérdidas no son significativas en 35 d. Sreerama & Hardin (2003): Los envases no cerrados perfectamente provocan pérdidas de hasta 30%. Parsons (2002): La cámara de aire en recipientes provocaría pérdidas. ONeal & Poklis (1996): 58 Bacterias pueden producir etanol post toma de muestra. Helander & Beck (2004): EtG y EtS son buenos biomarcadores de consumo.

28 Resultados y discusión Concentración de alcohol etílico (g/L) y relación entre productos de putrefacción y estándar interno en sangres enteras almacenadas en distintas condiciones de temperatura y con % variables de cámara de aire (CA). MCA % Ai3d 25ºC 3d 4°C 3d -10° 7d 25ºC 7d 4°C 7d -10°C 15d 25ºC 15d 4°C 15d -10°C 30d 25ºC 30d 4°C 30d -10°C Nd Nd2.65Nd 2.55 R Nd Nd5.35Nd Nd R Nd Nd3.56Nd 3.50 R Nd1.52Nd 1.45 R Nd2.28Nd Nd R

29 Con el objeto de modelar el decaimiento del etanol en función del tiempo, se ensayaron varias cinéticas siendo la de pseudo-primer orden la que presentó el mejor ajuste: Integrando dC/C = - k o dt k o = constante aparente de decaimiento de pseudo primer orden (1/día) C = concentración de etanol a tiempo t Co es la concentración inicial de etanol (g/ L) t = tiempo (días).

30 Cinética de decaimiento del etanol en muestras de sangre a) 25 C, b) 4 C y c) –10 C, 0%CA, 5%CA, 20%CA, 35%CA, 65%CA. La velocidad de decaimiento del etanol aumenta en función del incremento del porcentaje de %CA y de la temperatura. ln(C/Co Un buen ajuste de los datos experimentales se logró con la cinética propuesta

31 Temperatura ( C) %CAln C/Co (g/L)Ko (1/días)R2R Se observa que el parámetro k o varía marcadamente con la variación del %CA en el envase, modificándose substancialmente en los casos que el %CA aumenta de 35% a 65% para cada temperatura estudiada. Parámetros obtenidos del ajuste de la cinética propuesta con datos experimentales. (R 2 : coeficiente de determinación).

32 ko (1/días ) %Cámara de aire ,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 Variación de ko con el %CA El parámetro ko cambia marcadamente con la variación del %CA. Mayor modificación se observó al incrementarse de 35% a 65% a las tres temperaturas.

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34 T (ºC) ,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 Efecto de la T de almacenamiento sobre ko 0%CA 5%CA 20%CA 35%CA 65%CA Ko Ko (1/día) (1/día)

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36 Predicción del tiempo necesario para la reducción de la conc. de etanol a la mitad de la incial. Se utilizan gráficos de contorno para predecir la variación de parámetros frente a diversas variables. Se utiliza la ecuación: Ko=a-b.T. E l gráfico permite predecir el t necesario para que la concentración de etanol caiga a la mitad del valor inicial Tpo(días) T (ºC) 0%CA, 5%CA,20%CA,35%CA65%CA 0%CA, 5%CA,20%CA,35%CA65%CA

37 Cálculo de la energía de activación La variación de la constante cinética (ko) con T sigue generalmente una variación tipo Arrhenius. Donde T es la temperatura en ºK, EA es la energía de activación (KJoule/mol). A es un factor preexponencial y R es la constante de los gases 8.31 (KJoule/ºK mol). Aplicando logaritmos se obtiene: Representando ln (k o ) en función de 1/T es posible calcular la EA de la pendiente del grafico correspondiente. La Figura muestra las regresiones de Arrhenius para los diferentes porcentajes de cámara de aire presente en el recipiente. (EA) puede ser considerada como la sensibilidad que presenta la constante de decaimiento de la concentración de etanol (ko) frente a los cambios térmicos. 1/T (K) ,33,43,53,63,73,83, %CA,5%CA,20%CA,35%C A65%CA Ln (ko)

38 Menores valores de EA se obtienen para el caso de 65% %CA indicando que ko es influenciado por %CA que por T Mayor EA se observa a 0%CA sugiriendo que a 0%CA influyeT. Entre 5 y 35%CA, valores intermedios EA es posible que exista interacción entre T y %CA afecten (ko)

39 Efecto de %CA y temperatura sobre ko a 4 y 25ºC, donde (kCAj) corresponde al valor (k0) a 0%CA y (kCAi) al valor (k0) para diferentes %CA (5, 20, 35 y 65%). (k Ti ) corresponde al valor (k0) a -10ºC T de < degradación. (k Tj ) corresponde al valor (k0) a 4 y 25ºC.

40 Isobolograms Permiten analizar posibles interacciones entre variables (%CA y T)sobre el decaimiento del etanol Permiten analizar posibles interacciones entre variables (%CA y T)sobre el decaimiento del etanol Es posible expresar la contribución de cada factor en combinación, con el objeto de estudiar la evaluar efectos aditivo, sinergísta y antagonista Es posible expresar la contribución de cada factor en combinación, con el objeto de estudiar la evaluar efectos aditivo, sinergísta y antagonista Efecto de (E CA ) y (E T ) sobre (ko) (degradación de etanol) Efecto de (E CA ) y (E T ) sobre (ko) (degradación de etanol)

41 Geáficos muestran Geáficos muestran tres tipos de interaciones: tres tipos de interaciones: Aditivo cuando el efecto de uno de los factores (%CA o T) puede agregar al efecto causado por el otro. Sinergismo uno de los factores aumenta el efecto del otro. Antagonismo uno de los factores disminuye el efecto causado por el otro.

42 Predicción de la concentración inicial de etanol Predecir la Co de etanol en muestras almacenadas a T y %CA constante. Predecir la Co de etanol en muestras almacenadas a T y %CA constante. Si el tiempo en esas condiciones es conocido, midiendo la concentración de etanol a un específico tpo, es posible estimar la Co Si el tiempo en esas condiciones es conocido, midiendo la concentración de etanol a un específico tpo, es posible estimar la Co

43 = %CA/100 = %CA/100 T = temperatura Kelvin T = temperatura Kelvin t = tiempo en días t = tiempo en días Cf concentración de etanol al tiempo (t), Cf concentración de etanol al tiempo (t), Ω y δ constantes Ω y δ constantes Ω = (g/L) 5/3.día -1 δ = (K -2 ). Ω = (g/L) 5/3.día -1 δ = (K -2 ). Vales en T: (-10 a 25ºC), %CA= (0 y 54), Vales en T: (-10 a 25ºC), %CA= (0 y 54), Tiempo de 0 a 30 días Tiempo de 0 a 30 días Concentración etanol final entre 0 a 4.5 g/L Concentración etanol final entre 0 a 4.5 g/L

44 ( ) Este estudio ( ) Winek con preservador ( ) Winek sin preservador Ajuste de los datos experimentales (r 2 =0.9998) en 29 casos

45 Estudio de relación de áreas entre la señal previa al estándar interno (amina de putrefacción) y estándar interno: isopropanol (R). ( R ) en función del tiempo a las diferentes condiciones estudiadas ( R ) en función del tiempo a las diferentes condiciones estudiadas 25ºC 25ºC 4ºC 4ºC -10ºC -10ºC R

46 Estudio de la variación de etanol agregado a muestras de sangre entera sin contenido de etanol, bajo diferentes condiciones de preservación. M%CAAi3d 25ºC 3d 4°C 3d -10° 7d 25ºC 7d 4°C 7d -10°C 15d 25ºC 15d 4°C 15d -10°C 30d 25ºC 30d 4°C 30d -10°C , Se eligió sangre entera por ser ésta la muestra más habitual recibida en el laboratorio forense

47 Efecto del almacenamiento a diferentes temperaturas sobre muestras de sangre entera sin agregado de alcohol y con 5% de NaF y 5%CA. 25ºC, 4ºC, -10ºC

48 Variacion de la concentración de alcohol agregada a muestras de sangre entera con NaF y 5%Ca a)25ºC, b) 4ºC c) -10ºC Concentración inicial 0.84gt/L, 1.64 g/L, 2.70 g/L y 3.56 g/L Valores de ko /día.

49 La cámara de aire en las muestras sanguíneas remitidas para estudio de etanol se constituye en el factor más importante de pérdida del alcohol. La descomposición de sustancias orgánicas complejas ejerce poca influencia en las pérdidas o generación de alcohol, cuando son analizadas por Cromatografía gaseosa instrumental. La preservación de la sangre a bajas temperaturas, NaF y con 5% de cámara de aire ofrece muy buenas posibilidades de que el resultado sea aceptablemente repetitivo en el tiempo y hasta por lo menos 30 días posteriores a la toma de muestra

50 El modelo cinético elaborado en base a los resultados obtenidos se adaptan a lo consignado por otros autores para la estimación de las pérdidas ee etanol en muestras con pequeña cámara de aire o sin ella. El modelo cinético elaborado en base a los resultados obtenidos se adaptan a lo consignado por otros autores para la estimación de las pérdidas ee etanol en muestras con pequeña cámara de aire o sin ella.


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