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Dispersión de luz (light scattering) Matías Möller Fisicoquímica Biológica 1.

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Presentación del tema: "Dispersión de luz (light scattering) Matías Möller Fisicoquímica Biológica 1."— Transcripción de la presentación:

1 Dispersión de luz (light scattering) Matías Möller Fisicoquímica Biológica 1

2 Dispersión de luz Por qué el cielo es azul? Cómo se ve el cielo de la luna? 2

3 Dispersión de luz John William Strutt Lord Rayleigh 3

4 Dispersión de luz El fotón incidente induce un dipolo oscilante en la nube electrónica. Al cambiar el dipolo, la energía se irradia-dispersa en todas direcciones. 4

5 Dispersión de luz por proteínas Intensidad de luz dispersada es proporcional a la masa molecular y concentración Sensible a la presencia de pequeñas cantidades de agregados Polidispersity (homogeneidad) control de calidad, cristalización de proteínas 5

6 Dispersión de luz por proteínas Se puede analizar de diferentes maneras: Intensidad promedio (Estática) (SLS, static light scattering) Fluctuaciones en la intensidad (Dinámica) (DLS, dynamic light scattering) 6

7 Dispersión de luz estática Medida de masas moleculares Intensidad promedio de dispersión es función de la masa molecular y el 2 do coeficiente virial K = constante óptica MM = masa molecular A 2 = 2 do coeficiente virial C = Concentración (g/L) R = relación de Rayleigh (término que incluye la intensidad) 7

8 Dispersión de luz estática Constante Factor de forma, = 1 si r < 60 nm Relación de Rayleigh (para r m < /10) 8

9 Dispersión de luz estática La intensidad de luz dispersada que produce una macromolécula es proporcional al producto de la masa molecular promedio y la concentración de la macromolécula (I α MM.C) Si no hay dependencia entre la intensidad de dispersión y el ángulo de medida, se puede determinar MM con medidas en un solo ángulo Un gráfico de Debye permite la determinación de: – MM absoluta – 2do coefciente virial (A2) 9

10 Dispersión de luz estática Gráficos de Debye: Preparar un número de concentraciones de la proteína en un buffer apropiado 10

11 Dispersión de luz estática Ecuación de Rayleigh Una gráfica de KC/R vs C debería dar una linea recta cuyo intercepto a cero concentración será 1/M W y el gradiente A 2 11

12 Dispersión de luz estática 12

13 Dispersión de luz estática 13

14 Dispersión de luz estática 2 do coeficiente virial Propiedad termodinámica que describe la fuerza de interacción entre la molécula y el solvente Si A 2 > 0, las moléculas tienden a permanecer en solución (la proteína prefiere el buffer) Si A 2 = 0 la fuerza de la interacción proteína-solvente es equivalente a la fuerza de la interacción proteína-proteína (el solvente se llama solvente theta) Si A 2 < 0, la proteína tiende a precipitar o agregar 14

15 Dispersión de luz estática 15

16 Dispersión de luz estática 16 Masa molecular de proteínas

17 Dispersión de luz estática Medidas En batch/cubeta En línea combinado con un paso de fraccionamiento, principalmente Cromatografía de exclusión molecular 17

18 Dispersión de luz estática La masa molecular medida en experimentos de dispersión son MM promediada por el peso (fracción en g) Para un sistema simple de dos componentes con proteína monomérica y agregados: 18

19 Dispersión de luz estática Para determinar MM individuales: Fraccionar la muestra Combinar medidas de dispersión con un paso de fraccionamiento SEC / MALS 19

20 Dispersión de luz estática 20 (índice de refracción)

21 Dispersión de luz estática 21

22 Dispersión de luz estática 22

23 Dispersión de luz estática 23 (índice de refracción)

24 Dispersión de luz estática Señal de dispersión R α MM C Debido a alta MM, los agregados dispersan fuertemente Variación angular en la Intensidad de luz dispersada se relaciona con el tamaño de la molécula La luz dispersada por agregados muestra dependencia angular, mientras que la luz dispersa por monómeros y dímeros no. 24

25 Dispersión de luz estática 25 (índice de refracción)

26 26

27 27

28 Dispersión de luz estática 28

29 Dispersión de luz estática 29

30 Dispersión de luz estática 30

31 Dispersión de luz estática Pros Determinacion de MM rapida y exacta (promedio) de macromoleculas en solución Combinando SEC-MALS se puede determinar MM con una precision ± 5% Dependencia angular de señal de LS detecta agregados SEC-MALS permite detectar y cuantificar poblaciones de proteinas según sus MM Puede determinar estado oligomerico de polipeptidos modificados (prot-acidos nucleicos, glicosilados, etc. 31 Contras Mide MM promedio, necesita separación para distinguir estados oligoméricos Posible perdida de muestra durante filtración y fraccionamiento

32 Dispersión de luz Dinámica 32

33 Dispersión de luz Dinámica 33 DLS Permite determinar el tamaño de moléculas y nanopartículas Mide las fluctuaciones en la intensidad de dispersión con el tiempo para determinar el coeficiente de difusión translacional (D), y luego el radio hidrodinámico La velocidad de fluctuaciones depende del tamaño de la partícula - molécula

34 Dispersión de luz Dinámica 34 Fluctuaciones son resultado del movimiento browniano y puede correlacionarse con el coeficiente de difusión y el tamaño

35 Dispersión de luz Dinámica La temperatura tiene que ser estable y exactamente determinada (regular la viscosidad y evitar la convección) Las partículas más grandes se mueven más lentamente A mayor temperatura, más rápido se mueven las moléculas La velocidad del movimiento Browniano está definido por el coeficiente de difusión translacional (D) 35

36 Dispersión de luz Dinámica Las fluctuaciones en la intensidad no son al azar, sino consecuencia del confinamiento de las partículas a sitios cercanos a la posición inicial en tiempos muy cortos 36

37 Dispersión de luz Dinámica 37 Autocorrelación

38 Dispersión de luz Dinámica correlograma 38

39 Dispersión de luz Dinámica 39

40 Dispersión de luz Dinámica 40

41 Dispersión de luz Dinámica 41

42 Dispersión de luz Dinámica 42

43 Dispersión de luz Dinámica 43

44 Dispersión de luz Dinámica 44

45 Dispersión de luz Dinámica 45

46 Dispersión de luz Dinámica 46

47 Dispersión de luz Dinámica 47

48 Dispersión de luz Dinámica 48

49 Dispersión de luz Dinámica Pros En cubeta, muy rápida detección de agregados y evaluación de la polidispersión de la muestra con un amplio rango dinámico Adecuado para estudiar cinética de agregación Detector disponible para placas, parara screening Contras Mide radio hidrodinámico, es cual es afectado por la forma de la partícula No puede distinguir entre cambios de forma o estado de oligomerización Necesita fraccionamiento para resolver oligómeros presentes en una mezcla 49

50 Bibliografía Protein sizing by light scattering, molecular weight and polydispersity, Malvern Instruments presentation, 50


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