Biotecnología Vegetal Transformación génica en plantas

Presentación del tema: "Biotecnología Vegetal Transformación génica en plantas"— Transcripción de la presentación:

1 Biotecnología Vegetal Transformación génica en plantas

2 Biotecnología Vegetal
La biotecnología consiste en la utilización de organismos vivos con fines industriales Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o parte de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines determinados Se utilizan las técnicas de ingeniería genética y cultivo de tejidos vegetales in vitro

3 Sistemas de transformación genética en plantas
Planta transgénica Se introduce un DNA foráneo en el genoma de sus células, este DNA se expresa y confiere a la planta un carácter o unos caracteres nuevos Sistemas de transformación genética en plantas Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. - Sistemas basados en virus vegetales. Sistemas de transferencia directa de ADN - Transferencia por biobalística (micropartículas de oro o tungsteno que tiene aglomerado el DNA foráneo). - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación - Transferencia por microinyección.

4 ¿Para qué plantas transgénicas?
Rendimiento y calidad nutricional Biorreactores Estudio de procesos biológicos

5 Rasgos introducidos Resistencia a:
insectos herbicidas virus, hongos, bacterias Retraso de senescencia, tolerancia a estrés Mejora del valor biológico (proteínas, lípidos) Producción de polipéptidos de uso farmacológico.

6 Biotecnologías de apoyo al mejoramiento de plantas
Cultivo de tejidos Rescate de embriones Embriogénesis somática Organogénesis somática Producción de haploides Fusión de protoplastos Trasformación genética Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Métodos directos Métodos Indirectos

7 Cultivo de tejidos Factores comunes
Composición general de medios de cultivo: Fuente de Carbono (azúcares) Macronutrientes (N, K, etc) Micronutrientes (Fe, Cl, etc) Vitaminas Agente gelificante (para medios sólidos) Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) Otros compuestos (ej: agentes quelantes) ambientación asepcia cultivo

8 Cultivo de tejidos: Rescate de embriones

9 Cultivo de tejidos: Embriogénesis somática

10 Cultivo de tejidos: Organogénesis somática
Propagación masiva Flores Frutales Árboles forestales Cultivo de meristemas Saneamiento de virus Rejuvenecimiento

11 Cultivo de tejidos: Producción de haploides

12 Cultivo de tejidos: Fusión de protoplastos

13 Transformación genética Técnicas básicas
Enzimas de restricción Clonación de genes Secuenciación Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN Hibridación con anticuerpos (western blot) Hibridación de ácidos nucleicos (southern, northern) Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)

14 Transformación genética Técnicas básicas
Enzimas de restricción Clonación en plásmidos (vectores)

15 Transformación genética Técnicas básicas
Clonación en plásmidos (vectores)

16 Transformación genética Técnicas básicas
Secuenciación A C G T

17 Transformación genética Técnicas básicas: Secuenciación

18 Transformación genética Técnicas básicas
Electroforesis (DNA, RNA,proteinas) southern northern western

19 Transformación genética Técnicas básicas
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

20 Métodos indirectos Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes

21 Transformación genética:A. tumefaciens

22 Agrobacterium tumefaciens
Bacteria del suelo Gram (-) Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens Agallas en corona

23 Agrobacterium tumefaciens
Bacteria Gram negativa que infecta a las plantas en lugares donde hay heridas y produce la enfermedad de las agallas en corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas. Las agallas son protuberancias formadas por conglomerados de células indeferenciadas El plásmido Ti (tumor-inducing) es el responsable de la inducción de tumores, durante la infección se transfiere una porción definida de este plásmido: T-DNA (DNA de transferencia) La integración y expresión de ciertos genes del T-DNA (oncogenes) hace que las células transformadas se dividan sin control. Codifican para la síntesis de fitohormonas (auxinas y citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para la bacteria).

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25 ¿Qué son los genes vir? Codifican factores esenciales para la transferencia e integración del T-DNA dentro del genoma de la planta. Están ubicados en una regíón de 35 kb del plásmido Ti fuera de la región del T-DNA. Hay 25 genes vir distribuídos en 7 operones. Responden a un metabolito secundario exudado por las plantas cuando se les provoca una herida (acetosiringona)

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27 Transformación genética:A. tumefaciens
Proceso de infección T-DNA y región de virulencia (Plásmiso Ti) Genes cromosómicos de virulencia (chv) 1. Reconocimiento Agrobacterium-célula vegetal 2. La liberación de compuestos fenólicos por parte de la célula vegetal (acetosiringona) 3. El gen vir A se expresa de manera constitutiva y la proteína Vir A es activada por compuestos fenólicos y activa entonces al gen Vir G 4. Que produce la activación de otros genes de la región vir 5. Las proteínas VirD1 y VirD2 actúan en forma conjunta como une endonucleasa y liberan la cadena del T-DNA 6. Luego se une la proteína VirE al T-DNA y se forma el complejo T que protege al DNA de la degradación 7. Proteínas codificadas en vir B forman un canal que posibilita la transferencia 8. Las proteínas VirD2 y Vir E2 permiten el reconocimiento molecular para el ingreso del T-DNA al núcleo y luego se produce la integración al genoma vegetal

28 Vectores derivados del plásmido Ti
Componentes necesarios: Marcador de selección (resistencia a kanamicina) Origen de replicación (para que se replique en E.coli) Borde derecho de la secuencia T-DNA Polylinker (región de multiple clonaje) Tipos: binarios cointegrados

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30 Transformación genética:A. tumefaciens

31 Se inocula con Agrobacterium desarmada que contenga un vector de transformación. El T-DNA contiene un módulo de expresión y el gen de resistencia a la kanamicina El medio además de hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima (para controlar el crecimiento de Agrobacterium) y kanamicina (antibiótico de selección)

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33 Agrobacterium rhizogenes
Cultivo de raíces de tabaco transformadas por Agrobacterium rhizogenes En este caso se utiliza como vector de transformación la bacteria con su plásmido Ri intacto y además se introduce otro plásmido que contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA. Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea de la planta Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus Gentileza del Dr. Mark Tepfer

34 Métodos directos Bombardeo de partículas (biobalistica)
Electroformación de Protoplasto Fibras de carburo de silicio “Whiskers” Transformación mediada por Glicol de polietileno (PEG)

35 Transformación genética:Biobalística

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37 Manipulación de la expresión génica
Promotores: constitutivos (35S del virus del mosaico del coliflor) tejido específicos (FBPasa - Rubiscom) inducibles Secuencias “enhancer” Intrones que estabilizan el mRNA producido Secuencia terminadora (nopalina sintasa)

38 Manipulación posttranscripcional
Antisentido Se transfiere un gen que codifica para un RNA complementario (asRNA) al mRNA de interés. Al transcribirse ambos genes se forma un híbrido asRNA-mRNA que impide la traducción del último.

39 GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN PLANTAS TRANSGÉNICAS
Tipo de gen utilizado en transgénesis Caracter que confiere a la planta Toxina de Bacillus thuringensis Proteína de la cubierta viral Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros organismos Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos bactericidas Genes cuyos productos afectan la biosíntesis de aminoácidos, o la fotosíntesis Genes cuyos productos afectan la biosíntesis del etileno, o la formación de pared celular Resistencia a Insectos Resistencia a Virus Resistencia a Hongos Resistencia a Bacterias Resistencia a Herbicidas Retraso maduración de frutos

40 ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)
Cultivo (Fecha liberación) Nombre Compañía Caraterísticas Tomate (1994) Flavr Savr Calgene Savor de madurez en rama, largavida Tomate (1995) Zeneca Consistencia de pasta de tomate Algodón Papas Maiz ( ) Bollgard NewLeaf YieldGuard Monsanto Toxina deBacillus thuringiensis para resistencia insectos Soya Raps Algodón (95-96) Roundup Ready Resistencia a Glifosato (herbicida)

41 OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS
Abeto Acelga Alfalfa Algodón Alamo Arabidopsis Arroz Arveja Camote Caña de azucar Cebada Centeno Clavel Crisantemo Espárrago Eucalyptus Frambuesa Frutilla Kiwi Lechuga Lirio Maíz Maní Manzana Maravilla Orquidea Papa Papaya Petunia Pera Pino Plátano Poroto Poroto de soya Remolacha Repollo Rosa Sorgo Tabaco Tomate Tulipán Trigo Vides Zanahoria Zapallo

42 MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Transformación de Plantas Biobalística o Agrobacterium Mejoramiento Genético Resistencia a Patógenos Resistencia a Herbicidas Esterilidad Sexual Calidad del Producto Roundup Listo Materna Paterna Insectos Hongos Bacterias Color Postcosecha

43 Glifosato Glifosato Bromoxinil

44 Asignacion Definicion Rescate de embriones Embriogénesis somática
Organogénesis somática Producción de haploides Fusión de protoplastos Plasticidad Totipotencia Monocotiledodeas Dicotiledoneas