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ʺ ANÁLISIS DE FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS Ile-58Thr y Ala-9Val EN EL GEN MnSOD, Ala-73Thr EN EL GEN CST3 y Ala-224Val EN EL GEN CTSD y SU.

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1 ʺ ANÁLISIS DE FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS Ile-58Thr y Ala-9Val EN EL GEN MnSOD, Ala-73Thr EN EL GEN CST3 y Ala-224Val EN EL GEN CTSD y SU ASOCIACIÓN CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EN PACIENTES DEL HOSPITAL ANDRADE MARÍN EN ECUADOR ʺ Carrera de Ingeniería en Biotecnología Elaborado por: Carla Geovanna Rodríguez Proaño Director: Dr. Marcelo Grijalva, MD., PhD. Codirectora: Ing. Paola Párraga

2 Instituto de Investigaciones Biomédicas (UDLA) XXXV Jornadas Nacionales de Biología – I Congreso Ecuatoriano de Mastozoología III Congreso Ecuatoriano de Genética Humana y las Primeras Jornadas Ecuatoriano Españolas de Enfermedades Raras -¿Raras?- VI Congreso Internacional de Genética Humana y XII Congreso Colombiano de Genética

3 Introducción 1era Causa de demencia pérdida de neuronas funciones cognitivas Lesiones placas seniles y degeneración neurofibrilar tomografía por emisión de positrones (PET)

4 Síntomas Pérdida de memoria Problemas de lenguaje P. motores P. físicos P. de lógica mental P. de personalidad Trastornos del sueño Causas Tumores en el cerebro Infecciones Esclerosis múltiple Parkinson Enfermedad de Lyme Falta de vitamina B12 Diagnóstico Historia clínica paciente y familia Estudio anatomopatológico con datos clínicos

5 Formulación y Justificación del problema EA interviene del 60% al 70% en los casos de deterioro cognitivo -grado de afectación del 10% en individuos > 65 años y un 40% para individuos >85 años 35.6 millones de personas - año 2030 se incremente este valor a 65.7 millones y se triplique para el año 2050 INEC, año año año

6 Genes de Estudio MnSOD Tomado de NCBI Tomado de GeneCards

7 T C Sustitución Isoleucina Treonina Alanina Valina Transición Disfunción de los mecanismos de protección de las neuronas Efecto Hierro/Manganeso Superóxido dismutasa Enzima antioxidante Organismos aeróbicos Defensa de las células para atrapar los radicales libres de oxígeno fosforilación oxidativa O2ˉ H2O2 + O 2

8 CST3 Tomado de GeneCards Tomado de NCBI

9 G A Sustitución Alanina Treonina Transición envejecimiento neuronal o muerte celular Efecto Cistatina C proteínas cistatinas de tipo 2, protectora Líquido cefalorraquídeo inhibidor endógeno de la proteasa cisteína

10 CTSD Tomado de GeneCards Tomado de NCBI

11 C T Sustitución Alanina Valina Transición Acumulación de la proteína TAU y beta- amiloide Efecto Catepsina D Proteasa aspártico intracelular Degradación proteolítica y la apoptosis División proteína precursora del amiloide (APP) en la beta-amiloide (Aβ) Degradación de la proteína tau en fragmentos

12 Objetivo General Analizar las frecuencias polimórficas de Ala-73Thr en el gen CST3 y Ala-224Val en el gen CTSD mediante PCR- RFLP e Ile-58Thr y Ala-9Val en el gen MnSOD mediante secuenciación y estudiar su asociación con la enfermedad de Alzheimer en pacientes del Hospital Andrade Marín en Ecuador.

13 Optimizar las condiciones de PCR-RFLP para los polimorfismos Ala-73Thr y Ala-224Val a ser estudiados. Optimizar las condiciones de PCR de secuenciación para los polimorfismos Ile-58Thr y Ala-9Val a ser estudiados. Probar los dos métodos optimizados en muestras de pacientes afectos por la enfermedad de Alzheimer y en muestras de individuos sanos. Determinar si existe correlación entre polimorfismos y riesgo de enfermedad entre los grupos control y estudio para enfermedad de Alzheimer y los polimorfismos estudiados. Objetivos Específicos

14 Las combinaciones alélicas de los genes MnSOD (Ile- 58Thr y Ala-9Val), CST3 (Ala-73Thr) y CTSD (Ala-224Val) están asociados con el desarrollo la enfermedad de Alzheimer. Hipótesis

15 ADN Pacientes: [ ] ug/mL Controles: [7 – 72.7] ug/mL Edad Pacientes: Promedio = 73.12± años Controles: Promedio = 72.38± 9.89 años Población # Total de individuos: 111 Pacientes: 26 hombres y 30 mujeres Controles: 31 hombres y 24 mujeres Materiales y Métodos

16 Ala-9ValIle-58ThrAla-73ThrAla-224Val AciIEagI BDT V pb217pb262pb203pb Muestras: 56 pacientes y 55 controles MnSODCST3CTSD PCR BDT V1.1 Ʀ

17 MnSOD (Ile-58Thr)MnSOD (Ala-9Val)CST3 (Ala-73Thr)CTSD (Ala-224Val) Primer F 5- TCCAGGGGAAGTACTGTTTG-3 5-GCTGTGCTTTCTCGTCTTCA TATCTAGCTCCAGCCTCTCG-3 5- GTCCATGTAGTTCTTGAGCA-3 Primer R 5- GCAGACCTCTTTGATGGTTG-3 5- CAACGCCTCCTGGTACTTCT-3 5-TACATGTCGTTGCTGGCTTT GGTGACCACTTCTTAGGACT-3 Tamaño del amplicón 264pb217pb262pb303pb ReactivosConcentración Buffer1X Mg++1.5mM2.5mM0.5mM1.5mM dNTPs0.2mM0.3mM0.1mM Primer F0.2μM 0.4μM Primer R0.2μM 0.4μM Platinum® Taq 2.5Units ADN5ng/µL5ng/μL 5ng/µL Volumen Total por Reacción: 50.00µL

18 PasosTemperatura °CTiempoAcción Desnaturalización inicial9510 minDesnaturalización 35 ciclos 9545sDesnaturalización 60.31minHibridación 7245sExtensión Elongación Final723minExtensión Final Conservación4 Tabla 2.2: Programa de PCR para la amplificación de MnSOD Ile-58Thr PasosTemperatura °CTiempoAcción Desnaturalización inicial9510 minDesnaturalización 36 ciclos 9545sDesnaturalización 621minHibridación 7245sExtensión Elongación Final723minExtensión Final Conservación4 Tabla 2.4: Programa de PCR para la amplificación de MnSOD Ala-9Val Imagen obtenida en:

19 PasosTemperatura °CTiempoAcción Desnaturalización inicial9510 minDesnaturalización 35 ciclos 9530sDesnaturalización 6045sHibridación 7245sExtensión Elongación Final723minExtensión Final Conservación4 Tabla 2.8: Programa de PCR para la amplificación de CTSD Ala-224Val PasosTemperatura °CTiempoAcción Desnaturalización inicial9510 minDesnaturalización 35 ciclos 9530sDesnaturalización 5330sHibridación 7245sExtensión Elongación Final723minExtensión Final Conservación4 Tabla 2.6: Programa de PCR para la amplificación de CST3 Ala-73Thr Imagen obtenida en:

20 Purificación con Agencourt® AMPure® XP

21 Reactivosx1 H2O ultra pura2.8 uL Buffer 5x2 uL BDT1 uL Primer 1mM3.2 uL PCR purificada2-4 uL Volumen Final11-13 uL PasosTemperatura °CTiempoAcción Desnaturalización inicial 9610 minDesnaturalización 25 ciclos 9630sDesnaturalización 5045sHibridación 6045sExtensión Conservación4 Imagen obtenida en:

22 Purificación con Agencourt® CleanSEQ®

23 Resultados y Discusión Ile-58Thr Figura 3.6: Fotografía del gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en el que se visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de MnSOD (Ile-58Thr) de 264pb

24 Ala-9Val Figura 3.8: Fotografía del gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en el que se visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de MnSOD (Ala-9Val) de 217pb

25 Ala-73Thr Figura 3.4: Fotografía del gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en el que se visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de CST3 (Ala-73Val) de 262pb

26 Ala-224Val Figura 3.2: Fotografía del gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en el que se visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de CTSD (Ala-224Val) de 303pb

27 Ala-73Thr CST3 Figura 3.5: Fotografía del gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio, revelando los diferentes genotipos de la restricción para el polimorfismo Ala-73Val con la enzima EagI. En el posillo 2 se representa el genotipo heterocigoto G/A, en el posillo 4 el genotipo homocigoto raro A/A y en el posillo 6 el genotipo homocigoto normal G/G

28 Rodríguez C., 2012 Ala-224Val CTSD Figura 3.3: Fotografía del gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio, revelando los diferentes genotipos de la restricción para el polimorfismo Ala-224Val con la enzima AciI. En el posillo 7 se representa el genotipo heterocigoto C/T, en el posillo 11 el genotipo homocigoto raro T/T y en el posillo 13 el genotipo homocigoto normal C/C

29 Ile-58Thr MnSOD Figura 3.7: Representación gráfica del genotipo normal T/T de la secuenciación capilar de MnSOD (Ile-58Thr)

30 Ala-9Val MnSOD a) b)

31 Ala-9Val MnSOD c) Figura 3.9: Representación gráfica de: a) genotipo normal T/T, b) genotipo heterocigoto T/C y c) genotipo normal C/C de la secuenciación capilar de MnSOD (Ala-9Val)

32 Gen (polimorfismo)Genotipo# de casos% en la población Alelo % CST3 (Ala-73Val) a G/G % G85.14% G/A98.11% A14.86% A/A % CTSD (Ala-224Val) a C/C % C77.03% C/T % T22.97% T/T54.5% MnSOD (Ile-58Thr) a T/T111100% T C/T-- C- C/C-- MnSOD (Ala-9Val) a T/T % T41.44% C/T % C58.56% C/C % a Para cada polimorfismo se realizó el análisis en una población de 111 individuos

33 GenPoblaciónGenotipo No. De individuos % Frecuencia Genotípica Frecuencia esperada Frecuencia alélica HWE (P) MnSOD T9C Afectos T/T (0.32) T/C C/C Total56 Controles T/T (0.99) T/C C/C Total55 CST3 G73A Afectos G/G ( ) G/A A/A Total56 Controles G/G ( ) G/A A/A Total55 CTSD C224T Afectos C/C (0.07) C/T T/T Total56 Controles C/C (0.5) C/T T/T Total55

34 GenGenotipo Afectos N(%) Controles N(%) OR a 95% IC b PX²ρ MnSOD T9C T/T13 (23.2)8 (14.5)1r1r 0.57 NS 0.45 T/C24 (42.9)26 (47.3) NS C/C19 (33.9)21 (38.2) NS T/C + C/C43 (76.8)47 (85.5) NS CST3 G73A G/G42 (75.0)48 (87.3)1r1r 51.27* G/A6 (10.7)3 (5.5) NS A/A8 (14.3)4 (7.3) NS G/A + A/A14 (25.0)7 (12.8) NS CTSD C224T C/C20 (35.7)45 (81.8)1r1r 0.21 NS 0.65 C/T32 (57.1)9 (16.4) * T/T4 (7.1)1 (1.8) * C/T + T/T36 (64.2)10 (18.2) * *: significativo, NS : no significativo, a : Odds ratio, b : intervalos de confianza, r : referencia, valores calculados con 1 grado de libertad

35 1.Ala-73Thr (G>A) del gen CST3, Ala-224Val (C>T) del gen CTSD, Ile-58Thr (T>C) y Ala-9Val (T>C) del gen PCR-RFLP (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica) y secuenciación capilar. 2.Estandarizó la técnica de PCR-RFLP para los polimorfismos Ala-73Thr y Ala-224Val. PCR de secuenciación para los polimorfismos Ile-58Thr y Ala-9Val para afectos y controles. 3.Ala-73Thr (G>A), presenta un leve impacto en la población ecuatoriana. 4.El análisis de equilibrio de Hardy-Weinberg para Ala-9Val (T>C) y Ala-224Val (C>T) confirmó que la población en estudio cumple con el equilibrio. Mientras que para Ala-73Thr (G>A) se obtuvieron valores que demuestran un desequilibrio de la población. 5.La prueba de Chi cuadrado confirmó los resultados del equilibrio de Hardy-Weinberg obteniendo valores no significativos para Ala-9Val (T>C) y Ala-224Val (C>T); y significativos para Ala-73Thr (G>A). 6.Finalmente, los resultados de interés que se encontraron en la prueba estadística de Odds ratio en la población ecuatoriana, fue de 8.1 veces más riesgo de que un individuo portador del alelo T, ligado a la enfermedad, desarrolle Alzheimer. Al tener las dos copias del alelo T, este riesgo se incrementa 9 veces más. Por ello, esta variante polimórfica puede desempeñar un importante rol biológico en la patogenia de EA. Conclusiones

36 Mantener las muestras de sangre siempre en frio y si se necesita realizar un traslado de la muestra, se recomienda mantener la cadena de frío para evitar degradación y daño a la muestra. Es preferible realizar una extracción de ADN a partir de sangre periférica el mismo día que se realizó la extracción de la sangre periférica, para así evitar que haya una degradación de la muestra por el transcurso del tiempo. En la estandarización de la PCR es mejor trabajar primeramente con volúmenes pequeños como 25µL para no malgastar los reactivos y ahorrar costos. Cuando ya se haya logrado estandarizar la técnica se aumenta el volumen a lo que se requiera. Para que no exista error en el genotipaje, es necesaria una adecuada optimización de las condiciones de PCR, debiéndose obtener bandas sólidas y de buena concentración de producto y de ese modo se puedan observar adecuadamente los fragmentos resultantes de la digestión enzimática. Si es que se utilizaría bromuro de etidio para la tinción de un gel de agarosa, es muy importante que este paso sea efectuado en una cámara de flujo laminar para evitar daños a nuestra salud, ya que el bromuro de etidio es altamente cancerígeno. En la secuenciación capilar es necesario utilizar una buena concentración y pureza de ADN, para obtener buenos resultados. De igual manera se debe realizar un buen proceso de purificación para que no existan interrupciones en la PCR de secuenciación, seguida de la electroforesis capilar de la misma. Debido a que la enfermedad de Alzheimer es multifactorial y autosómica dominante es importante realizar un estudio de más genes en la población ecuatoriana, ya que estudios en otras poblaciones no se aplican a nuestro entorno y así brindar un mejor entendimiento de la enfermedad en su complejidad molecular en nuestro país. Recomendaciones

37 Agradecimientos


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