ICBM COMPUTATIONAL ANALYSIS OF CELL BEHAVIOUR IN DEVELOPING EMBRYOS 16-28 |04|2007 Miguel Concha / Steffen Härtel Programa de Anatomía y Biología del Desarollo,

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1 ICBM COMPUTATIONAL ANALYSIS OF CELL BEHAVIOUR IN DEVELOPING EMBRYOS 16-28 |04|2007 Miguel Concha / Steffen Härtel Programa de Anatomía y Biología del Desarollo, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile

2 Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

3 Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Huygens Professional Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

4 Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

5 x/y z Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Confocal Microscopy 2-photon spinning disc STED conventional confocal 4- 

6 Basics of Fluorescence | Jablonski Diagram /  E,  t Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Intercombinación 10 -8 s 10 -6 - 1s Transiciones: con radiación Niveles: vibracionales sin radiación | -> calor electrónicos -> transferencia de energía (FRET) -> radicales... STED 10 -9 -10 -8 s Fluorescencia 10 -6 - 1s Fosforescencia 10 -15 s Absorción 10 -12 s Conversión interna x/y z

7 3| Microscopía confocal de fluorescencia: - Segmentation... - Color/Visualisation... -... Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

8 Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile 3. Segmentation

9 A. Transformación B. Umbral C. Erosión & Dilatación 3. Segmentation Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

10 H (x i,y j,r) · I(x,y) Mean: Simplest Low Pass Simplest High Pass 1 1 1 H =1/9 · 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 H = -1 8 -1 -1 -1 -1 3. Segmentation Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile H (x i,y j,r): X -> Y ->

11 - variaciones de H,... - introducción de reglas adicionales. H = Más filtros morfológicos : Filtros de polinomios : 3. Segmentation Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile H (x i,y j,r): X -> Y ->

12 3. Segmentation Definición de Minkowski Adición... Dilatación : Substracción... Erosión :... Opening :... Closing : S A

13 F = 1 2  F 1  F  1 F = 2 2  F 1  F  2 F = 3 4  F 1  F  3 F = 10 10  F 1  F  9 F = 192 193  F 1  F  192 3. Segmentation Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Filtros locales: - Lineales - No lineales Filtros globales: - Análisis de Fourier - Análisis de Wavelet -... Filtros especiales: - Análisis adaptativo -...

14 3. Segmentation Filtros locales: - Lineales - No lineales Filtros globales: - Análisis de Fourier - Análisis de Wavelet -... Filtros especiales: - Análisis adaptativo -... Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

15 ICBM COMPUTATIONAL ANALYSIS OF CELL BEHAVIOUR IN DEVELOPING EMBRYOS 16-28 |04|2007 Miguel Concha / Steffen Härtel Programa de Anatomía y Biología del Desarollo, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile

16 3. Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Representación simbólica o modelo individual del mundo real

17 3. Colores La fóvea S - Conos M - Conos L - Conos ‘Midget-Cell‘ Bastones Conos (S, M, L) -> 10 8 Bastones -> 6·10 6 Conos: L : M : S (primates) 580 nm : 545 nm : 420 nm ~10: ~10: 1 en cantidad y sensitividad [Azul] / [Amarillo]: [+S] / [M+L] [Verde] / [Rojo]: [M-L] / [L-M] Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

18 3. Colores 10 8 Conos & bastones Nervus opticus 8· 10 5 Células horizontales Células bipolares [Glutamato]~1/I Células amacrin Celulas del Ganglio Células del ganglio Se conocen~15 tipos diferentes de células de ganglio. Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

19 3. Colores ->[I, L, M, S, x, y, t] - Receptores: - [Glu] ~ [Na + ] en ‘Off-cells‘ bipolares - [Glu] ~ [Na + ] -1 en ‘On-cells‘ bipolares ->[] = [] + [dI/dt, dL/dt, dM/dt, dS/dt] ->[] = [] + [z] - Activación/Inhibición lateral: - Células horizontales emiten GABA, en caso de una excitación homogenia en [x,y] ->[] = [] + [dI/dxy, dL/dxy, dM/dxy, dS/dxy] Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

20 I( 290,267 ) = 220 r g b 0 : 220 : 255 0 : 220 : 255 0 : 220 : 255 Una mesa de color está definida por 3 vectores r, g, b de 8 bits c/u Amarillo (255, 255, 0) Negro (0, 0, 0) Rojo (255, 0, 0) Verde (0, 255, 0) Blanco (255, 255, 255) Cian (0, 255, 255) Magenta (255, 0, 255) Azul (0, 0, 255) red = [r 0, r 1,…...…...,r 255 ] green = [g 0, g 1,……...,g 255 ] blue = [b 0, b 1,……...,b 255 ] Un canal tiene 8 bits y se pueden codificar 256 colores o intensidades 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

21 r g b 000::::0::0000::::0::0 0 1 2 : 200 : 255 000::::0::0000::::0::0 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

22 r g b 0 1 2 : 220 : 255 000::::0::0000::::0::0 000::::0::0000::::0::0 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

23 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

24 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

25 r = [r 0, r 1, r 2,…...., r 255 ] = [0, 0, 0,……..,0] g = [g 0, g 1, g 2,…, g 255 ] = [0, 1, 2,…..,255] b = [b 0, b 1, b 2,…., b 255 ] = [0, 0, 0,……..,0] o = [o 0, o 1, o 2,….., o 255 ] = [255, 255,.,255] r = [r 0, r 1, r 2,…...., r 255 ] = [0, 1, 2,…..,255] g = [g 0, g 1, g 2,…, g 255 ] = [0, 0, 0,……..,0] b = [b 0, b 1, b 2,…., b 255 ] = [0, 0, 0,……..,0] o = [o 0, o 1, o 2,….., o 255 ] = [80, 80,…….,80] 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

26 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

27 3. 3D reconstruction | Colores Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile

28 The observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function (PSF) must be considered as a mini-sprectrofluorimeter: 1.You need to consider the Offset I(0) in order to calibrate your signal I(0)  0 ! 2.Never saturate the signal: I  I max (255 for 8 bit) ! I(0) > 0 I > I max Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Parameters for optimal image adquisition

29 From the Nyquist Theorem: The sampling frequency (or sampling distance) is a function of the observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function (PSF): 3.You need to consider sampling distances in  x and  y  50 nm and … 4.  z  150-300 nm for later deconvolution.  xy  50 nm Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Parameters for optimal image adquisition