The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes Ana Serrano Esteban.

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1 The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes Ana Serrano Esteban

2 INTRODUCCIÓN FAD SINTETASA (FADS) FMNAT RFK H2N COOH COOH H2N FMNAT
Riboflavina kinasa (RFK) Adenililtransferasa(FMNAT) Mg2+ Mg2+ ATP ADP ATP PPi Riboflavina (vitamina B2) FMN FAD Procariotas FAD SINTETASA (FADS) FMNAT RFK H2N COOH Las FADS son enzimas bifuncionales que catalizan la síntesis de FAD a través de la acción secuencial de dos actividades: una actividad riboflavina quinasa que cataliza la síntesis de FMN y una actividad adenilil transferasa que cataliza la síntesis de FAD. Enzimas bifuncionales solo han sido descritas en organismos procariotas. En mamíferos y levaduras, la síntesis de FMN y está catalizada por dos enzimas monofuncionales que actúan de forma independiente, bien con actividad RFK o con actividad FMNAT. COOH H2N FMNAT Eucariotas (levaduras y mamÍferos) RFK

3 FADS bifuncionales son esenciales para los microorganismos
INTRODUCCIÓN IMPORTANCIA DE LA SÍNTESIS DE FLAVINAS Reducción Biodegradación Reacciones no redox Emisión de luz Oxigenación Oxidación Producción de energía Reparación del DNA Desarrollo neuronal Detoxicación Plegamiento de proteínas Apoptosis Remodelado de cromatina Biosíntesis La síntesis de cofactores flavínicos es muy importante, ya que dichos cofactores participan en multitud de procesos celulares que son vitales para la célula. Esto hace que las FADS bifuncionales sean esenciales para los microorganismo. Además, junto con las diferencias que presentan con respecto a las enzimas monofuncionales les convierte en potenciales dianas terapeúticas. En este trabajo se utilizará la FADS de Corynebacterium ammoniagenes para profundizar en el mecanismo de acción de este tipo de enzimas. FADS bifuncionales son esenciales para los microorganismos Potenciales dianas terapéuticas

4 DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT)
RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes FAD FMN ATP PPi Mg2+ DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) N terminal (1-186) No presenta homología estructural ni secuencial con las FMNATs monofuncionales. Pertenece a la familia de las NTs. Riboflavina (vitamina B2) FMN ATP ADP Mg2+ DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK) Dado que al inicio de este trabajo no existía una estructura cristalográfica para la FADS de Corynebacterium ammoniagenes, el trabajo se inició proponiendo un modelo estructural. En este modelo la proteína, de 338 aa, se pliega en dos dominios independientes. El dominio N-terminal es el responsable de la actividad FMNAT. Este módulo no presenta homología secuencial o estructural con las FMNATs monofuncionales, más bien pertenece a la superfamilia de las nucleotidil transferasas. El dominio C-terminal es el responsable de la actividad RFK y comparte homología estructural y secuencial con las RFKs monofuncionales. C terminal ( ) Comparte homología estructural y secuencial con las RFKs monofuncionales.

5 INTERACCIÓN DEL MÓDULO RFK CON RF Y ADP
RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes INTERACCIÓN DEL MÓDULO RFK CON RF Y ADP E295 T208 N210 R292 F270 D310 K296 F297 K202 RF ADP E268 T208 N210 T208 D277 E268 E268 Y279 N210 V193 La comparación del módulo RFK de la FADS con las estructuras de RFKs monofuncionales en complejo con sus sustratos nos ha permitido proponer un modelo de interacción para dicho módulo con RF y ADP. Además el análisis secuencial de las FADS de organismos procariotas nos ha permitido localizar varios motivos conservados también están presentes en las RFKs, entre los que destaca el motivo PTAN, que en las RFKs está implicado en la unión del ATP. Asimismo el residuo E permanece invariable en todas las secuencias analizadas y se propone que actúa como base catalítica. Teniendo en cuenta los modelos estructurales y el análisis secuencial se han producido mutantes en las posiciones T208, N210 y E268 para analizar su implicación en la interacción con los ligandos así como en la actividad catalítica de este módulo. 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP Frago et al. (2008) BMC Microbiol 8:160

6 RESULTADOS: MÓDULO RFK
INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL) 350 400 450 500 550 -0.002 0.000 0.002 0.004 Wavelength (nm) -0.008 -0.004 0.008 0.012 0.006 Absorbance / [FADS] WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D FADS:RF FADS:FMN FADS:FAD Módulo FMNAT Módulo RFK RF Módulo FMNAT Módulo RFK ADP RF Módulo FMNAT Módulo RFK FMN Módulo FMNAT Módulo RFK ADP FMN Módulo FMNAT Módulo RFK FAD FADS-ADP:RF FADS-ADP:FMN 350 400 450 500 550 -0.008 -0.004 0.000 0.004 0.008 0.012 Wavelength (nm) -0.002 0.002 0.006 Absorbance / [FADS] Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 La titulación de los diferentes mutantes del módulo RFK con RF, FMN y FAD produce la aparición de un espectro diferencial en el visible indicando que todas las variantes mantienen la capacidad de unir las flavinas, al menos en uno de los sitios de unión. A pesar de que todos producen espectros similares, el desplazamiento de los máximos y en su intensidad indican cambios en el entorno del anillo de isoaloxacina durante la interacción. La importantes disminución de la intensidad en la interacción de los mutantes en la posición T208 al interaccionar con RF sugieren la pérdida de un sitio de unión. Dado que las mutaciones se localizan lejos de los sitios de unión a flavina propuestos en el modulo FMNAT y RFK los resultados sugieren que las mutaciones inducen cambios en los sitios de unión a las mismas. La unión a RF y FMN en presencia de ADP aumenta la magnitud del espectro diferencial observado. En el caso del FMN este hecho es consistente con la aparición de un segundo sitio de unión para FMN en presencia del nucleótido.

7 Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610
RESULTADOS: MÓDULO RFK INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC) FADS:RF Módulo FMNAT Módulo RFK FAD ΔG ΔH -TΔS -50 -40 -30 -20 -10 10 20 30 40 Kcal/mol N=2 N=1 WT N210D T208D T208A E268D E268A N210A KdRF (µM) 10mM Mg2+ WT 24.1 T208A 61.5 T208D 7.8 N210A 18.7 N210D 12.2 E268A 13.8 E268D 8.3 KdFAD (µM) KdFMN (µM) 10mM Mg2+ WT 0.74 7.84 T208A 0.86 7.96 T208D 1.19 8.74 N210A 1.11 6.21 N210D 17.3 3.56 E268A 24.7 72.4 E268D 1.12 6.88 Módulo FMNAT Módulo RFK RF Módulo FMNAT Módulo RFK RF Módulo FMNAT Módulo RFK FMN Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 El residuo T208 está implicado en la interacción de la RF en el módulo RFK. FADS:FAD FADS:FMN -50 -40 -30 -20 -10 10 20 30 40 Kcal/mol WT N210D T208D T208A E268D E268A N210A N=1 N<1 -50 -40 -30 -20 -10 10 20 30 40 Kcal/mol N=1 N<1 WT N210D T208D T208A E268D E268A N210A La caracterización de la interacción de la WT con RF mediante ITC indico la presencia de dos sitios de unión, uno en cada módulo de la enzima. Además la interacción esta dirigida entálpicamente con una contribución entrópica desfavorable. El análisis de los mutantes del dominio RFK indica la perdida de uno de los sitios de unión para los mutantes en la posición T208. La diferencia de interacción de ambos mutantes con la RF indica que además este residuo modula la interacción en el segundo sitio de unión. El resto de mutantes muestran una afinidad ligeramente superior a la WT como consecuencia de una contribución entálpica menos favorable y una contribución entrópica más favorable. El análisis de la interacción de la WT FADS con FAD y FMN indicó la presencia de un único sitio de unión. Todos los mutantes mantienen la estequiometria. La unión de ambas flavinas está dirigida por una contribución entálpica muy favorable y una contribución entrópica desfavorable. Para la interacción con FAD los parámetros termodinámicos son similares a la WT para todos los mutantes, sin embargo la afinidad decrece para los mutantes N210D y E268A. Para el FMN el único mutante que tiene afectada la afinidad es el E268A, sin embargo los parámetros termodinámicos cambian tanto para este mutante como para el mutante N210D. Los residuos N210 y E268 parecen contribuir a la interacción de las flavinas en el otro módulo.

8 RESULTADOS: MÓDULO RFK
INTERACCIÓN CON ATP (ITC) -50 -40 -30 -20 -10 10 20 30 40 Kcal/mol WT N210D T208D T208A E268D E268A N210A N=2 N=1 N<2 0mM Mg2+ 3.88 2.62 2.48 7.06 4.28 4.29 3.49 KdATP (µM) 10mM Mg2+ WT 30.2 T208A 15.7 T208D 12.7 N210A 20.6 N210D 12.1 E268A 15.4 E268D 25.0 ΔG ΔH -TΔS Módulo FMNAT Módulo RFK ATP 10 mM Mg2+ Módulo FMNAT Módulo RFK ATP 10 mM Mg2+ El residuo T208 está implicado en la estabilización del nucleótido en el módulo RFK. La titulación de la WT FADS con ATP en presencia de 10 mM de Mg indico la presencia de dos sitios de unión, uno en cada módulo de la proteína. La unión al nucleótido está dirigida entálpicamente con una contribución entrópica desfavorable. La sustitución del residuo T208 produce la pérdida de uno de los dos sitios de unión, hecho que confirma que la cadena de Thr está implicada en la estabilización del nucleótido en el módulo RFK. Además todos estos mutantes fueron titulados en ausencia de Mg, ya que previamente se había sugerido que en estas condiciones el ATP se uniría preferiblemente al módulo RFK. Los resultados aquí presentados indicarían que la unión en ausencia del ión se produce en el módulo FMNAT, ya que los mutantes en la posición 208 son capaces de interaccionar con el nucleótido manteniendo incluso la misma afinidad que la WT. Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 Módulo FMNAT Módulo RFK 0 mM Mg2+ ATP Módulo FMNAT Módulo RFK 0 mM Mg2+ ATP En ausencia de Mg2+ el ATP se une preferiblemente al módulo FMNAT. Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

9 Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610
RESULTADOS: MÓDULO RFK INTERACCIÓN CON FMN EN PRESENCIA DE ADP (ITC) -15 -10 -5 5 10 Kcal/mol WT N210D T208D T208A E268A N210A N=2 Site 1 Site 2 N=1 E268D KdFMN (µM) WT Site 1 0.04 Site 2 0.90 T208A N=1 1.46 T208D 0.97 N210A 4.53 N210D 63.9 1.29 E268A 0.92 0.11 E268D N=2 6.43 Módulo FMNAT Módulo RFK FMN La titulación de la FADS con FMN en presencia de ADP induce la aparición de un segundo sitio de unión que previamente se ha relacionado con el módulo RFK. La presencia de ADP además cambia el perfil termodinámico haciendo que la interacción sea más fuerte. Los mutantes fueron titulados en estas condiciones para comprobar si son capaces de mantener la interacción en este segundo sitio de unión. Las mutaciones introducidas en el residuo T208 así como la sustitución de N210 por Ala previenen la aparición de este segundo sitio de unión. Los residuos T208 y N210 parecen claves para alojar las flavinas en el módulo RFK. Módulo FMNAT Módulo RFK ADP FMN ADP FMN Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

10 RESULTADOS: MÓDULO RFK
ACTIVIDAD RFK Riboflavina (vitamina B2) FAD FMN ATP ADP ATP PPi Mg2+ kcat (min-1) KmRF (µM) Ki ADP kcat / KmRF (min-1 µM-1) KmATP kcat / KmATP WT <302 <13 4.0 23.2 68 13.7 4.93 N210D 5.1 2.1 10.1 2.42 2.5 45.3 0.05 E268D 2.7 4.1 --- 0.65 4.2 17.6 0.23 WT  N210D E268D La actividad RFK se determinó siguiendo la evolución de la RF como la suma de FMN y FAD formados durante la reacción. Cuando se determinó la actividad para la WT FADS a concentración saturante de ATP, la velocidad de reacción se vio disminuida a concentraciones superiores a 5 uM, sugiriendo inhibición por exceso de sustrato y la formación de un complejo no productivo con la Ez. Todas las mutaciones produjeron efectos muy negativos en la actividad RFK impidiendo en la mayoría de los casos la formación de los productos. Solo se observó transformación de la RF para los mutantes N210D y E268D con una reducción muy importante de la constante catalítica, siendo la inhibición solo detectable para N210D.

11 RFK Saccharoymices pombe
Herguedas et al. (2010) J Mol Biol 400:218 T208 V271 La interacción con el ATP debe implicar un cambio conformacional. F270 P207 Mg 2+ N210 E268 CaFADS Bauer et al. (2010) J Mol Biol 326:1463 P44 P44 H98 Durante este trabajo se ha resuelto la estructura cristalográfica de la CaFADS. Al modelar los sustratos en el módulo RFK se observa la posición que los residuos aquí estudiados tendría en el centro activo de la enzima. En esta estructura el residuo T208 no interacciona con el ATP. El hecho de que las mutaciones introducidas en dicho residuo impiden la unión del ATP, indicaría que tienen que producirse cambios conformacionales durante la interacción con el nucleótido, tal como ocurre en las RFKs monofuncionales. De hecho en SpRFK la posición equivalente experimenta un cambio conformacional durante la unión con los ligandos permitiendo que el residuo establezca interacciones con el ATP. H98 T45 Mg 2+ T45 Mg 2+ E96 N47 E96 N47 RFK Saccharoymices pombe (SpRFK) SpRFK:FMN:ADP

12 INTERACCIÓN DEL MÓDULO FMNAT CON ATP Y FMN
RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes INTERACCIÓN DEL MÓDULO FMNAT CON ATP Y FMN 28 31 FMN Y106 H57 V59 L98 F128 P56 P58 F62 F54 R161 I62 H28 R168 T165 S164 D25 F24 A124 N125 L34 H31 R161 I62 H28 R168 T165 S164 D25 F24 A124 N125 L34 H31 ATP ATP R161 164 165 161 H31 S164 H28 La comparación del módulo FMNAT con las estructuras de NTs en complejo con sus sustratos ha permitido proponer un modelo de interacción del dominio N-terminal de la FADS con el ATP. Este modelo permite sugerir un gran número de residuos que podrían estar implicados en la interacción con los diversos grupos del ATP. El análisis secuencial de las FADS de organismos procariotas, ha permitido identificar varios motivos conservados en este módulo, además conservados en la familia de las NTs y que se proponen que estan implicados en la interacción con el ATP. Asímismo por primera vez se ha propuesto un sitio de interacción para el FMN en dicho módulo. T165 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP Frago et al. (2008) BMC Microbiol 8:160

13 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT
INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL) 350 400 450 500 550 -0.004 0.000 0.004 Wavelength (nm) Absorbance / [FADS] FADS:RF WT H28A H28D R161A R161D S164A S164D T165A T165D Módulo FMNAT Módulo RFK Flavinas Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 350 400 450 500 550 -0.004 0.000 0.004 0.008 Wavelength (nm) 350 400 450 500 550 -0.004 0.000 0.004 0.008 Wavelength (nm) FADS:FMN FADS:FAD Igualmente al titular los mutantes del módulo FMNAT con RF, FMN y FAD apareció de un espectro diferencial el visible indicando que todos ellos son capaces de unir las flavinas. Los cambios más significativos se observan al titular con FMN y FAD. Dado que en ausencia de ADP las flavinas se unen en el módulo FMNAT, estos resultados indican que las mutaciones modifican la conformación de la interacción proteína-flavina.

14 Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610
RESULTADOS: MÓDULO FMNAT -60 -40 -20 20 40 60 Kcal/mol WT S164D R161A H28D T165D T165A S164A N=1 N<1 R161D N<<1 H31D H31A H28A FADS:FMN ΔG ΔH -TΔS INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC) Kd FMN (µM) WT 7.84 H28A 13.87 H28D 7.88 H31A 6.54 H31D 6.15 R161A 18.1 R161D 19.4 S164A 1.41 S164D 5.27 T165A 95.0 T165D 2.01 Kd FAD (µM) WT 0.74 H28A 3.32 H28D 1.83 H31A 8.08 H31D 12.3 R161A 0.75 R161D 2.11 S164A 26.2 S164D 26.6 T165A 11.3 T165D 0.36 -60 -40 -20 20 40 60 Kcal/mol WT S164D R161A H28D T165D T165A S164A N=1 N<1 R161D N<<1 H31D H31A H28A FADS:FAD La titulación de estas variantes con las flavinas, FMN y FAD indicó que todos los mutantes mantienen la misma estequiometría que la proteína nativa. Algunas de estas variantes mostraron una menor afinidad por FMN, especialmente destacable para la variante T165A. En cuanto al perfil termodinámico, excepto para la sustitución de His por Asp, el resto de mutantes en las His así como en la Ser mostraron unas entalpias de interacción muy bajas. El cambio entálpico tan grande indica una organización diferente en la interacción entre estos mutantes y la flavina. Módulo FMNAT Módulo RFK Flavinas Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

15 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT
INTERACCIÓN CON ATP (ITC) ΔG ΔH -TΔS Kd,av ATP (µM) WT 30.2 H28A 647.7 H28D 131.5 H31A 42.9 H31D 49.2 R161A 26.7 R161D 226.4 S164A 75.7 S164D 103.7 T165A 32.18 T165D 77.1 -60 -40 -20 20 40 60 Kcal/mol WT S164D R161A H28D T165D T165A S164A N=2 N<2 R161D H31D H31A H28A FADS:ATP El análisis de la interacción con ATP indicó que todos ellos mantienen la misma estequiometría que la WT FADS, con dos sitios de unión. Sin embargo los mutantes de la H28 y S164, así como el mutante R161D y el T165D tienen muy afectada la constante de disociación. Además la mayoría de los mutantes mostraron contribuciones entálpicas menos favorables y contribuciones entrópicas más favorables indicando que el sitio de unión al ATP en el modulo FMNAT se ve alterado por la presencia de las mutaciones. Módulo FMNAT Módulo RFK ATP El sitio de unión al ATP en el módulo FMNAT queda alterado por la presencia de las mutaciones. Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

16 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT
ACTIVIDAD FMNAT kcat (min-1) KmFMN (µM) KmATP kcat / KmFMN (min-1 µM-1) kcat / KmATP WT 97.4 6.2 46.4 15.7 2.10 R161A 18.7 6.4 27.5 2.90 0.68 R161D 29.9 16.8 24.9 1.78 1.20 S164A 34.3 33.5 212.7 1.02 0.16 T165A 12.0 69.6 124.7 0.17 0.10 T165D 7.4 113.8 15.1 0.07 0.49 FAD FMN ATP PPi Mg2+ Los residuos de His son críticos para la actividad FMNAT. WT R161A R161D S164A T165A  T165D Las mutaciones en los dos residuos de His produce formas incapaces de transformar FMN en FAD indicando que estas posiciones son cruciales para la actividad FMNAT. Asímismo la sustitución del residuo S164 por Asp produjo una forma incapaz de catalizar la reacción. El resto de variantes produjo efectos negativos en la constante catalítica, así como en las constantes de michaelis para FMN y ATP, previniendo la inhibición por sustrato. Todos ellos son menos eficientes para la transformación de FMN en FAD.

17 Herguedas et al. (2010) J Mol Biol 400:218
N125 R161 PPi H31 H28 S164 T165 W181 R168 La estructura cristalográfica de la CaFADS en complejo con PPi muestra una cavidad abierta donde se propone que se unen los sustratos y productos. La parte central de esta cavidad es una superficie cargada positivamente que contribuye a estabilizar los grupos fosfato de los ligandos. Los residuos aquí mutados contribuyen a formar está cavidad. ATP binding cavity Isoalloxazine binding cavity Isoalloxazine binding cavity ATP binding cavity

18 DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK)
CONCLUSIONES DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK) T208 E268 N210 E268 T208 N210 H28 H31 N210 T208 T208 ADP ATP Mg2+ RF Mg2+ PPi Estos resultados nos han llevado a proponer un mecansimo en el que la RF y el Mg se unirían en el dominio C-terminal, provocando un cambio conformacional permitiendo la unión del ATP a través del residuo T208. Posteriormente, se produciría un ataque directo del 5’OH de la RF activado por residuo Glu268 el fosfato γ, coordinado con el metal y se liberaría primero el ADP seguido del FMN. En cuanto al dominio N-terminal, la unión del ATP induciría un cambio conformacional que permitiría la posterior unión del FMN. Es muy posible este dominio presente un mecanismo catalítico similar al de las NT α/β fosfodiesterasas, en el que los grupos funcionales de los residuos del centro activo del enzima no contribuyen mediante interacciones de tipo covalente o ácido-base a la catálisis, sino que tras la unión, los sustratos quedan perfectamente orientados en el centro activo, de tal forma que se favorece un ataque nucleofílico directo sobre el fosfato α del ATP, y se produce la liberación del pirofosfato a la vez que la enzima estabiliza el estado de transición, el cual posteriormente evoluciona a la formación del nuevo enlace fosfodiéster entre el fosfato del FMN y el del AMP. Siendo el fad liberado en ultimo lugar. FMN FMN ATP Mg2+ FAD

19 Milagros Medina Trullenque
AGRADECIMIENTOS Milagros Medina Trullenque Adrián Velázquez-Campoy