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The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes Ana Serrano Esteban.

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Presentación del tema: "The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes Ana Serrano Esteban."— Transcripción de la presentación:

1 The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes Ana Serrano Esteban

2 Riboflavina (vitamina B2) FAD FMN ATP ADP ATP PP i Mg 2+ INTRODUCCIÓN FMNATRFK H2NH2N COOH FAD SINTETASA (FADS) Procariotas COOH H2NH2N FMNAT Eucariotas (levaduras y mamÍferos) RFK H2NH2N COOH FMNAT Riboflavina kinasa (RFK)Adenililtransferasa(FMNAT)

3 INTRODUCCIÓN Reducción Biodegradación Reacciones no redox Emisión de luz Oxigenación Oxidación Producción de energía Reparación del DNA Desarrollo neuronal Detoxicación Plegamiento de proteínas Apoptosis Remodelado de cromatina Biosíntesis FADS bifuncionales son esenciales para los microorganismos IMPORTANCIA DE LA SÍNTESIS DE FLAVINAS Potenciales dianas terapéuticas

4 RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes N terminal (1-186) C terminal ( ) Riboflavina (vitamina B2) FMN ATP ADP Mg 2+ DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK) FAD FMN ATP PP i Mg 2 + DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) o No presenta homología estructural ni secuencial con las FMNATs monofuncionales. o Pertenece a la familia de las NTs. o No presenta homología estructural ni secuencial con las FMNATs monofuncionales. o Pertenece a la familia de las NTs. o Comparte homología estructural y secuencial con las RFKs monofuncionales.

5 T208 N210 RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes E268 INTERACCIÓN DEL MÓDULO RFK CON RF Y ADP E295 K296 R292 D310 E268 F297 F270 T208 N210 V193 Y279 K202 D277 RF ADP 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP E268 T208 N210 Frago et al. (2008) BMC Microbiol 8:160

6 RESULTADOS: MÓDULO RFK INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL) FADS:RFFADS:FMN FADS:FAD Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm) Absorbance / [FADS] WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D FADS-ADP:RFFADS-ADP:FMN Wavelength (nm) Absorbance / [FADS] Wavelength (nm) Módulo FMNAT Módulo RFK RF Módulo FMNAT Módulo RFK FMN Módulo FMNAT Módulo RFK FAD Módulo FMNAT Módulo RFK ADP FMN ADP FMN Módulo FMNAT Módulo RFK ADP RF ADP RF Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

7 El residuo T208 está implicado en la interacción de la RF en el módulo RFK Kcal/mol N=1 N<1N=1 N<1 WTN210DT208DT208AE268DE268AN210A Kcal/mol WTN210DT208DT208AE268DE268AN210A N=1 N<1N=1 N<1 K d FAD (µM)K d FMN (µM) 10mM Mg 2+ WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D RESULTADOS: MÓDULO RFK INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC) K d RF (µM) 10mM Mg 2+ WT24.1 T208A61.5 T208D7.8 N210A18.7 N210D12.2 E268A13.8 E268D8.3 ΔG ΔH -TΔS FADS:RF FADS:FAD FADS:FMN Kcal/mol N=2 N=1 N=2 WTN210DT208DT208AE268DE268AN210A Los residuos N210 y E268 parecen contribuir a la interacción de las flavinas en el otro módulo. Módulo FMNAT Módulo RFK RF Módulo FMNAT Módulo RFK RF Módulo FMNAT Módulo RFK FAD Módulo FMNAT Módulo RFK FMN Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

8 Kcal/mol WTN210DT208DT208AE268DE268AN210A N=2 N=1 N<2N=2 N<2 RESULTADOS: MÓDULO RFK INTERACCIÓN CON ATP (ITC) K d ATP (µM) 10mM Mg 2+ WT30.2 T208A15.7 T208D12.7 N210A20.6 N210D12.1 E268A15.4 E268D25.0 ΔG ΔH -TΔS En ausencia de Mg 2+ el ATP se une preferiblemente al módulo FMNAT. El residuo T208 está implicado en la estabilización del nucleótido en el módulo RFK. 0mM Mg Módulo FMNAT Módulo RFK ATP 10 mM Mg 2+ Módulo FMNAT Módulo RFK ATP 10 mM Mg 2+ Módulo FMNAT Módulo RFK 0 mM Mg 2+ ATP Módulo FMNAT Módulo RFK 0 mM Mg 2+ ATP Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

9 K d FMN (µM) WTSite Site T208AN=11.46 T208DN=10.97 N210AN=14.53 N210DSite Site E268ASite Site E268DN=26.43 RESULTADOS: MÓDULO RFK INTERACCIÓN CON FMN EN PRESENCIA DE ADP (ITC) Los residuos T208 y N210 parecen claves para alojar las flavinas en el módulo RFK. Módulo FMNAT Módulo RFK ADP FMN ADP FMN Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 Módulo FMNAT Módulo RFK FMN

10 ACTIVIDAD RFK RESULTADOS: MÓDULO RFK k cat (min -1 ) K m RF (µM) K i ADP (µM) k cat / K m RF (min -1 µM -1 ) k cat (min -1 ) K m ATP (µM) k cat / K m ATP (min -1 µM -1 ) WT<302< N210D E268D Riboflavina (vitamina B2) FAD FMN ATP ADP ATP PP i Mg 2+ WT N210D E268D

11 E268N210 P207 T208 Mg 2+ F270 V271 E96N47 P44 T45 Mg 2+ H98 E96 N47 P44 T45 Mg 2+ H98 RFK Saccharoymices pombe (SpRFK) SpRFK:FMN:ADP CaFADS La interacción con el ATP debe implicar un cambio conformacional. Herguedas et al. (2010) J Mol Biol 400:218 Bauer et al. (2010) J Mol Biol 326:1463

12 R161 I62 H28 R168 T165 S164 D25 F24 A124 N125 L34 H31 R161 I62 H28 R168 T165 S164 D25 F24 A124 N125 L34 H RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes ATP FMN Y106 H57 V59 L98 F128 P56 P58 F62 F54 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP INTERACCIÓN DEL MÓDULO FMNAT CON ATP Y FMN R161 H28 T165 S164 H31 Frago et al. (2008) BMC Microbiol 8:160

13 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL) FADS:RF FADS:FMN FADS:FAD Wavelength (nm) Absorbance / [FADS] Wavelength (nm) Wavelength (nm) WT H28A H28D R161A R161D S164A S164D T165A T165D Módulo FMNAT Módulo RFK Flavinas Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

14 K d FAD (µM) WT0.74 H28A3.32 H28D1.83 H31A8.08 H31D12.3 R161A0.75 R161D2.11 S164A26.2 S164D26.6 T165A11.3 T165D0.36 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT K d FMN (µM) WT7.84 H28A13.87 H28D7.88 H31A6.54 H31D6.15 R161A18.1 R161D19.4 S164A1.41 S164D5.27 T165A95.0 T165D2.01 INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC) ΔG ΔH -TΔS FADS:FMN FADS:FAD Kcal/mol WT S164D R161A H28D T165D T165A S164A N=1 N<1 N=1 N<1 N=1 R161D N<<1 H31D N=1 H31A H28A N= Kcal/mol WT S164D R161A H28D T165D T165A S164A N=1N<1N=1 N<1N=1 R161D N<<1 H31D N=1 H31A H28A N=1 El cambio entálpico tan grande indica una organización diferente en la interacción entre estos mutantes y la flavina. Módulo FMNAT Módulo RFK Flavinas Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

15 K d,av ATP (µM) WT30.2 H28A647.7 H28D131.5 H31A42.9 H31D49.2 R161A26.7 R161D226.4 S164A75.7 S164D103.7 T165A32.18 T165D77.1 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT INTERACCIÓN CON ATP (ITC) ΔG ΔH -TΔS Kcal/mol WT S164D R161A H28DT165DT165A S164A N=2 N<2 N=2 R161D N=2 H31D N=2 H31A H28A N=2 El sitio de unión al ATP en el módulo FMNAT queda alterado por la presencia de las mutaciones. FADS:ATP Módulo FMNAT Módulo RFK ATP Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

16 RESULTADOS: MÓDULO FMNAT k cat (min -1 ) K m FMN (µM) K m ATP (µM) k cat / K m FMN (min -1 µM -1 ) k cat / K m ATP (min -1 µM -1 ) WT R161A R161D S164A T165A T165D ACTIVIDAD FMNAT FAD FMN ATP PP i Mg 2 + WT R161A R161D S164A T165A T165D Los residuos de His son críticos para la actividad FMNAT.

17 PP i N125 H31 R161 R168 H28 S164 T165 ATP binding cavityIsoalloxazine binding cavity W181 ATP binding cavity Isoalloxazine binding cavity Herguedas et al. (2010) J Mol Biol 400:218

18 CONCLUSIONES RF ATP T208 N210 T208 E268 N210 E268 T208 N210 Mg 2+ ADP FMN Mg 2+ ATP Mg 2+ FMN H28 H31 PPi FAD DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK)

19 Milagros Medina Trullenque Adrián Velázquez-Campoy AGRADECIMIENTOS


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