Tecnología en Bioquímica y Biología Molecular.

Presentación del tema: "Tecnología en Bioquímica y Biología Molecular."— Transcripción de la presentación:

1 Tecnología en Bioquímica y Biología Molecular.
4º Biología. Curso José María Pérez Freije Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, 4.15 Tel

2 Homogeneización de muestras biológicas
Obtener biomoléculas en forma soluble Disgregar tejidos Lisar células

3 Homogeneización de muestras biológicas
Procedimientos mecánicos Métodos químicos (detergentes, agentes caotrópicos) Métodos enzimáticos

4 Homogeneización de muestras biológicas
Elección del método de homogeneización Material biológico de partida. Naturaleza y cantidad Biomolécula a analizar o purificar. Sensibilidad a degradación enzimática, oxidación, etc- Finalidad. Necesidad o no de preservar la estructura y/o función de orgánulos o de la propia biomolécula Control de la temperatura

5 Métodos mecánicos de homogeneización
Molienda con partículas de vidrio Pulverización de tejidos congelados Homogeneizadores de émbolo y tubo Homogeneizadores rotor/estator Presurización/despresurización Nebulización Ultrasonidos

6 Molienda con partículas de vidrio
Rotura basada en el impacto con bolas (vidrio, acero, cerámica) Impacto Tensión de cizalla Cambios de presión Necesidad de controlar la temperatura Aplicaciones frecuentes: rotura de microorganismos (bacterias, levaduras, esporas) Formatos: agitación del recipiente (manual o automática) agitación interna

7 Molienda con partículas de vidrio Trituradores con agitación interna
Escala preparativa Sistemas refrigerados Aplicaciones frecuentes: rotura de microorganismos (bacterias, levaduras, esporas) Triturador Dyno-Mill

8 Pulverización de muestras congeladas
La utilización de morteros permite triturar tejidos congelados hasta pulverizarlos completamente. La homogeneización con nitrógeno líquido (-196 ºC) impide la degradación y desnaturalización de las biomoléculas Muy útil para obtener RNA de tejidos ricos en nucleasas o difíciles de homogeneizar Morteros convencionales de cerámica, morteros especiales de acero

9 Homogeneizadores de émbolo y tubo
Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado. Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales frágiles como cerebro e hígado. No es eficiente en la fragmentación de microorganismos. Preferido en preparación de orgánulos subcelulares Acciónvsuave. Permite un buen control de la temperatura generada por la fricción.

10 Homogeneizadores de émbolo y tubo
vidrio (hueco) / vidrio (Tenbroeck) Teflón / vidrio (Potter Elvehjem) vidrio / vidrio (Dounce)

11 Teflón / vidrio (Potter Elvehjem)
Homogeneizadores de émbolo y tubo Teflón / vidrio (Potter Elvehjem)

12 Homogeneizadores rotor/estator (“politrón”)
Disrupted cells Cell suspension Stator Consisten en un rotor que gira a alta velocidad en el interior de un tubo perforado que permanece fijo (estator) Homogenización rápida (10-60 s) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera. Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición. Uso: tejidos animales y vegetales. Extracción de RNA.

13 Presurización/despresurización
French Press Presurización/despresurización Inventada por Stacy French Se usa para romper bacterias y levaduras La suspensión de microorganismos se introduce en la célula de presión (cilindro de acero) y se aplica presión mediante un émbolo y una prensa hidráulica Los microorganismos estallan debido al cambio de presión que experimentan al abrir una válvula

14 Sonicación Aplica ultrasonidos a suspensiones celulares Cavitación.
Volúmenes variables (0.1 ml – 500 ml) Microorganismos, células eucariotas Fragmenta ácidos nucleicos, disminuye la viscosidad Genera cantidades importantes de calor

15 Métodos mecánicos de homogeneización

16 Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
Tampón Sal, sacarosa Detergentes Agentes desnaturalizantes (urea, guanidinio) Inhibidores de proteasas Inhibidores de nucleasas Inhibidores de fosfatasas Agentes reductores

17 Detergentes Moléculas anfipáticas: Grupos polares y apolares
Grupos polares: puentes de hidrógeno con agua Grupos apolares: agregan por interacciones hidrofóbicas Concentración micelar crítica (CMC): concentración a partir de la cual se forman micelas. Detergentes = surfactantes (disminuyen la tensión superficial del agua

18 Detergentes Tampón

19 Detergentes Detergentes iónicos (aniónicos, catiónicos) Sales biliares
Detergentes no iónicos Detergentes zwiteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT® 3-X) partir de la cual se forman micelas.

20 SDS: Dodecil sulfato sódico, lauril sulfato sódico

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24 Detergentes Detergentes iónicos (aniónicos, catiónicos) Sales biliares
Detergentes no iónicos Detergentes zwiteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT® 3-X)

25 Agentes desnaturalizantes
Ácidos, compuestos alcalinos Compuestos caotrópicos Urea Cloruro de guanidinio Solventes orgánicos (etanol, metanol, acetonitrilo, etc.) Compuestos reductores (DTT, 2-mercaptoetanol)

26 Lisis ezimática Bacterias: lisozima (N-acetylmuramide glycanhydrolase)
Levaduras: Zymolyase (Lyticase) Tejidos animales: Proteasas (colagenasa, dispasa, tripsina) Enzimas degradativos: proteasas, DNasas, RNasas

27 Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
Tampón RIPA (“Radio-Immunoprecipitation Assay”): lisado de cultivos celulares · Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 · NP-40: 1% · Na-deoxycholate: 0.25% · NaCl: 150 mM · EDTA: 1 mM · PMSF: 1 mM · Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 µg/ml each · Na3VO4: 1 mM · NaF: 1 mM

28 Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
Tampón GIT (extracción de RNA) * 4 M Guanidine thiocyanate * 25 mM Sodium Citrate * 0.5% Sarkosyl * 0.1 M Beta-Mercaptoethanol

29 Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular
Tampón “A” (lisis enzimática de bacterias) 50 mM Tris pH 7.9 50 mM Glucosa 1 mM EDTA

30 Lisis enzimática de bacterias
Centrifugar 10 min a 5000 rpm Tirar el SN, escurrir el tubo boca abajo sobre un papel. Resuspender el pellet con 50 ml de Buffer A. Tirar el SN, escurrir el tubo boca abajo sobre un papel. Resuspender el pellet con 10 ml de Buffer A. Pasar 1.5 ml a un tubo eppendorf de 2 ml. Guardar el resto congelado a -20ºC. Añadir 15 microlitros de lisozima (stock 100 mg/ml). Dejar 15 min a temperatura ambiente, volteando de vez en cuando. Congelar con hielo seco o Etanol frío a -80 ºC. Descongelar a 75 ºC. Congelar y descongelar de nuevo. Pasar a hielo. Centrifugar 20 minutos a rpm a 4 ºC. Recoger el sobrenadante