ELECTROFORESIS: Método analítico que permite separar moléculas biológicas, en función de su carga, en un campo eléctrico.

Presentación del tema: "ELECTROFORESIS: Método analítico que permite separar moléculas biológicas, en función de su carga, en un campo eléctrico."— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

2 ELECTROFORESIS: Método analítico que permite separar moléculas biológicas, en función de su carga, en un campo eléctrico

3 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Grado de pureza de una proteína. · Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

4 ELECTROFORESIS SDS-PAGE
SDS : dodecil sulfato de sodio DETERGENTE ANIÓNICO En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida

5 Electroforesis SDS-PAGE
REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Tetrametiletilendiamino (TEMED) N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Acrilamida Persulfato de amonio

6 ¿Cómo se forma la matriz (el gel)?

7 MATRIZ DE POLIACRILAMIDA
Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida

8 Acrilamida Químicamente inerte
Estable en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica Insoluble en agua La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN

9 Rango de separación (tamaño)
En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 15 – 45 kDa 12.5% 15 – 60 kDa 10% 18 – 75 kDa 7.5 % 30 – 120 kDa 5 % 60 – 212 kDa

10 ELECTROFORESIS SDS-PAGE
GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR Diferente pH Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2-5% acrilamida) pH Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7-15% acrilamida) pH 8.8 Tris-HCl SDS El buffer de corrida Tris/Glicina/SDS

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12 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina

13 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol

14 ¿Cómo se consigue el efecto concentrador?

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18 Marcadores de Peso Molecular preteñidos
¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida

19 Los geles se pueden teñir con:
Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

20 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF

21 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Distancia total Frente de corrida

22 Elaboramos una gráfica con los datos obtenidos de los estándares de peso molecular

23 Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa

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25 Procedimiento de proteína recombinante
Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final) Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

26 Peculiaridades de la construcción:
En el vector pET-TEM se insertaron los genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

27 Purificación de la proteína recombinante

28 Proteina GFP

29 Purificación de la proteína recombinante

30 RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO….
2h h h Después de la inducción