Sistema endócrino u hormonal

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1 Sistema endócrino u hormonal
Fisiología Animal Comparada – 2015 Sistema endócrino u hormonal Conjunto de órganos y tejidos (glándulas) que liberan sustancias (hormonas) Hormonas endócrinas Se vuelcan directamente en el sistema circulatorio Hormonas exócrinas Se vuelcan a través de un conducto a la superficie epitelial Hormonas: sustancias químicas que se secretan y actúan sobre un órgano blanco. Hormonas endócrinas se vuelcan a la circulación. Hormonas exocrinas se vuelcan a toda parte del animal que comunica con el medio exterior.

2 Fisiología Animal Comparada – 2015
Hormonas Sitios de síntesis neuronas modificadas en general en el hipotálamo  NEUROHORMONAS tejido endócrino no nervioso  HORMONAS Las hormonas ejercen su acción en células blanco, que presentan receptores específicos. Regulación autócrina: hormona actúa sobre el mismo tipo celular que la produce (ej: interleukinas) Regulación parácrina: hormona actúa sobre un tipo celular distinto, transportándose por la matriz extracelular y no por sangre (ej: interleukinas) Regulación endócrina: hormona actúa sobre un tipo celular distinto, transportándose por sangre. Interleukinas: proteínas secretadas por linfocitos y macrófagos, involucradas en la respuesta inmune.

3 Hormonas Según su naturaleza química pueden ser:
Fisiología Animal Comparada – 2015 Hormonas Según su naturaleza química pueden ser: - Polipéptidos: oxitocina, GH, TRH, LH, FSH, etc Receptores de membrana - Derivadas de aminoácidos catecolaminas hormonas tiroideas Receptores nucleares o citosólicos Hormonas peptídicas: aminoácidos Hormonas derivadas de aa: aa unidos por uniones covalentes. Catecolaminas: derivan de tirosina o fenilalanina (ej: adrenalina, dopamina, noradrenalina); hormonas tiroideas (2 aa tirosina que se unen covalentemente). Hormonas estroideas: derivadas del colesterol Las hormonas peptídicas y catecolaminas se almacenan en gránulos de secreción. Entonces hay dos procesos distintos: síntesis y secreción. Frente a un estímulo lo primero que ocurre es secreción y luego síntesis. Las hormonas esteroideas no se almacenan, por lo que la síntesis y secreción es lo mismo. El estímulo es para la síntesis y todo lo que se sintetiza se secreta. Lo que se almacena es el colesterol en gotas lipídicas sin membrana. Las hormonas tiroideas se almacenan extracelularmente. - Derivadas del colesterol (esteroideas): hormonas sexuales, glucocorticoides - Prostaglandinas: ácidos grasos hidroxicíclicos insaturados

4 Receptores de membrana Receptores citoplasmáticos/nucleares
Fisiología Animal Comparada – 2015 Receptores de membrana Receptores citoplasmáticos/nucleares Generally speaking, the bioregulator can be considered the first messenger carrying a signal from the secreting cell to a target cell. The first messenger binds to its receptor and may initiate the synthesis of cytosolic second messenger molecules that carry the bioregulatory signal into the interior of the cell. The message of relatively few molecules of first messenger is thereby amplified as many second messenger molecules are produced for each first messenger bound to a receptor and for as long as the receptor is occupied by the ligand (Figure 3-15). Activated G-proteins may interact directly with a signal-generating enzyme adjacent to or located in the membrane but on the cytosolic side. When a signal-generating enzyme is activated, it catalyzes the synthesis of a second messenger from a specific substrate. The second messenger then initiates intracellular events normally associated with the actions of the first messenger on that cell. G-proteins may also interact with ion channels in the cell membrane. Opening of a calcium channel can influence entrance or exit of calcium ions Ca2+ that, if a sufficient number of channels are affected, may in turn alter intracellular or membrane events. Hence, an ion such as Ca2+ that enters the cell and causes specific changes, such as activation of an enzyme, following binding of a bioregulator to its receptor also can be called a second messenger. Other types of receptors can influence Ca2+ influx by mechanisms that do not involve G-proteins. Once generated in a liver or skeletal muscle cell, cAMP can repeatedly combine with protein kinase A (PKA), a cytosolic enzyme that phosphorylates the inactive enzyme phosphorylase kinase which in turn coverts phosphorylase-b into its active form, phosphorylase-a. Active phosphorylase-a triggers the enzymatic breakdown of glycogen to provide glucose for energy production in the target cell (see Figure 3-18). In an adipose or fat cell, the cAMP-activated PKA activates a hormone-dependent lipase that results in hydrolysis of fats. Some receptors interact with yet another G-protein, the Gq-protein, that activates an additional signalgenerating enzyme complex called phospholipase C (PLC). The substrate for PLC is phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) which is cleaved to produce two second messengers, inositol trisphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG), each of which has independent actions. IP3 interacts with IP3-receptors on the external membrane of the endoplasmic reticulum to release stored Ca+2 into the cytosolic compartment of the cell. DAG and Ca2+ apparently activate the enzyme protein kinase C (PKC) which in turn may activate other cytoplasmic enzymes.

5 The pituitary gland or hypophysis was initially called the “master gland” because its hormones were shown to control many diverse systems that are essential for survival and reproduction. The later discovery of the complex control of the pituitary by the hypothalamus of the brain transferred our attention to the brain as being the “master gland,” and the pituitary became just another component of this major system for homeostatic regulation (see Figure 4-1). An overview of this system was provided in Chapter 1. Basically, neurosecretory (NS) neurons in the hypothalamus secrete hypothalamic-releasing hormones (Table 4-1) that travel to the pituitary gland where they regulate secretion of the pituitary tropic hormones (Table 4-2). These tropic hormones target certain peripheral endocrine glands (e.g., the thyroid gland) that in turn release their hormones (e.g., thyroid hormones) into the blood. These target gland hormones affect specific non-endocrine targets of their own and feedback on the hypothalamus and/or the pituitary. The axonal endings of many neurosecretory neurons terminate collectively in masses of capillaries to form what is called a neurohemal organ. These neurosecretory neurons release their neurohormones into the blood that flows through the neurohemal organ. The pituitary or hypophysis of adult mammals is located ventral to the brain just posterior to the optic chiasm, and it remains attached to the hypothalamus by a stalk-like connection (Figure 4-3). It is separable into two regions, the adenohypophysis and the neurohemal neurohypophysis. The adenohypophysis is an epithelial glandular structure (adeno, gland) and can be subdivided into three anatomical regions or pars (bodies): the pars anterior or pars distalis, the pars tuberalis, and the pars intermedia. An extensive vascular portal system, the hypothalamo-hypophysial portal system, develops between the median eminence of the neurohypophysis and the pars distalis of the adenohypophysis This portal system carries blood from the median eminence directly to the epithelial cells of the pars distalis. The capillaries of the pars nervosa connect directly with the general venous drainage system, and there are no associated portal vessels. The mammalian neurohypophysis consists of two distinct neurohemal components, the median eminence and the pars nervosa. The median eminence is defined as the more anterior portion of the neurohypophysis that has a blood supply in common with the adenohypophysis; specifically, the portal system. (Note that in some terminologies the median eminence is considered to be a subdivision of the hypothalamus but is considered by Green as a neurohemal subdivision of the neurohyphophysis.) An abundant but separate blood supply characterizes the pars nervosa (Figures 4-3 and 4-6), which is that posterior portion of the neurohypophysis in contact with the pars intermedia. Both the median eminence and the pars nervosa are composed of capillaries, pituicytes, and axonal tips of NS neurons originating in hypothalamic NS nuclei. The NS nuclei of the hypothalamus and preoptic area (POA; Figure 4-9) produce neurohormones that are stored in the neurohypophysis. Axons from these nuclei travel either to the median eminence (Figure 4-10) or to the pars nervosa. The neurohormones associated with the median eminence and adenohypophysis are the hypothalamic-releasing hormones and can be identified as either releasing hormones (RHs), or releaseinhibiting hormones (RIHs), depending on whether they stimulate or inhibit tropic hormone release from the adenohypophysis (Table 4-1). Five nonapeptides are stored in the adult mammalian pars nervosa and have been identified in the hypothalamus, although not all occur in the same species. These nonapeptides include the neutral nonapeptide oxytocin (OXY), as well as the basic nonapeptides arginine vasopressin (AVP), lysine vasopressin (LVP) in suiform mammals, and phenypressin (PVP) in macropodid marsupials (kangaroos and wallabies). In addition, mesotocin (MST) that is charactertistic of non-mammalian tetrapods (see Chapter 5) is found in some species as well as OXY and in others instead of OXY. The region of the mammalian brain that controls pars distalis function consists primarily of bilateral (paired) NS nuclei, including the anterior hypothalamic nucleus (AHN), suprachiasmatic nucleus (SCN), ventromedial nucleus (VMN), dorsomedial nucleus (DMN), posterior hypothalamic nucleus (PHN), supraoptic nucleus (SON), paraventricular nucleus (PVN), periventricular nucleus (PERIVN), and arcuate nucleus (ARC) (Figure 4-12). the hypothalamus, containing various NS nuclei, which are sources for the neurohormones involved with regulation of pituitary function. 5

6 Origin and targets for some hypothalamic-releasing and release-inhibiting hormones. Note that each hypothalamic hormone travels through the portal system and binds to receptors on different pars distalis cell types, evoking tropic hormone release. TRH, thyrotropin-releasing hormone; GnRH, gonadotropin-releasing hormone; CRH, corticotropinreleasing hormone; DA, dopamine or prolactin release-inhibiting hormone; TSH, thyrotropin; LH, luteinizing hormone; FSH, follicle-stimulating hormone; PRL, prolactin; ACTH, corticotropin.

7 1º orden Each hypothalamus-pituitary (HP) axis consists of the neurosecretory (NS) neurons within NS nuclei of the hypothalamic region of the brain, specific cell types in the pituitary that secrete tropic hormones, and the endocrine glands directly controlled by these tropic hormones. Reflejo neuroendócrino de primer orden: pocas estructuras involucradas, es muy rápido. Reflejo de segundo orden: nuevos componentes y son más los factores que pueden modular la respuesta. Refeljo de tercer orden: más lento y más complejo. The vasopressins (AVP, LVP) and PVP function as antidiuretic agents, increasing the ability of the kidneys to reabsorb water from the glomerular filtrate, reducing urine volume (antidiuresis). At higher doses, vasopressins cause vasoconstriction and can elevate blood pressure (pressor effect). This action may increase glomerular filtration and water excretion (diuresis). As mentioned earlier, OXY stimulates contraction of myoepithelial cells lining the ducts of the mammary glands and causes ejection of milk. The stimulatory action of OXY on the smooth muscle of the uterus is related to the induction of labor and the birth process. OXY also stimulates contractions in oviducts as well as in the vas deferens (sperm duct) of males. The hypothalamic nonapeptide neurohormones are synthesized in the SON and the PVN. 3º orden 2º orden

8 Retroalimentación en general negativa
Fisiología Animal Comparada – 2015 Regulación de la producción hormonal - CRH ACTH Retroalimentación en general negativa - Retroalimentación: hormona final regula a nivel de hipotálamo o de hipófisis. En general es negativa, un solo caso conocido de retroalimentación positiva (efecto de estrógenos en cierto momento del ciclo en hembras. Circuito largo: sobre hipotálamo e hipófisis Circuito corto: hipófisis actúa sobre hipotálamo Circuito ultracorto: hipotálamo sobre hipotálamo--- CHEQUEAR!!! Glucocor-ticoides

9 Cuantificación de hormonas
Fisiología Animal Comparada – 2015 ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) Se colocan en pocillos dentro de microplacas Muestras Tres tipos de ensayos: ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. Sistema de detección: Ac conjugados a enzimas (peroxidasa, fosfatasa alcalina) que producen una reacción cuyo producto es medido espectrofotométricamente

10 Cuantificación de hormonas
Fisiología Animal Comparada – 2015 RIA (Radio inmuno ensayo) Curva patrón Ag Ag* [Ac] = = [Ag*] Elementos necesarios Hormona fría Hormona marcada Ab anti-hormona Solución a analizar (ej: suero, hemolinfa) = = [Ag] < > Se separa el Ag* libre del complejo Ac-Ag* y se mide radiactividad del complejo Ac Hna* + Hna F + Ab HnaF- Ab + Hna*- Ab

11 Hibridación in situ de ARN
Fisiología Animal Comparada – 2015 Hibridación in situ de ARN Aporta información sobre la localización y el grado de expresión de un determinado gen Involucra el apareamiento de hebras complementarias de ARN Una sonda es un ácido nucleico (ADN o ARN) cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a la del ácido nucleico de interés (6). Para la HIS los nucleótidos en las sondas tienen que ser modificados o marcados para que se hagan evidentes después del proceso de hibridización con el material genético de interés (1, 7). Las sustancias más utilizadas en los protocolos de HIS son la biotina (vitamina H) para marcar la sonda y su afinidad con la avidina o la estreptavidina para detectar los sitios de hibridización; también se utilizan comúnmente la digoxigenina (un esteroide de la Digitalis purpurea) y la fluoresceína (FITC), que son muy fáciles de detectar en los tejidos (1, 2, 7, 8, 31-34). Las sondas marcadas con digoxigenina tienen una mayor sensibilidad y menos marcación inespecífica de fondo que las biotiniladas, además no existe en los tejidos animales (2, 35, 36). Las ventajas de este método son una mayor estabilidad de las sondas marcadas, resultados rápidos y una mejor resolución. La HIS es aplicable en células (frotis, centrifugados), secciones de tejidos (congelados, embebidos en parafina, semidelgados, en cortes ultradelgados de plástico) y en montajes de embriones frescos o de archivo (1, 2, 7). La fijación ideal para HIS debe preservar tanto el ARN como el ADN y la morfología de los tejidos, además debe permitir la penetración de las sondas. Por regla general la fijación no debe ser superior a 24 horas, incluso 15 a 60 min son suficientes para secciones de tejido delgadas (1, 2, 7, 37). Hay varios pasos que se deben seguir antes de la hibridización para aumentar su eficiencia y eliminar la marcación no específica de fondo. Estos son (figura 1): Tratamientos con proteasas. El tratamiento con proteasas y en especial la proteinasa K es el paso más importante para incrementar la disponibilidad de los ácidos nucleicos de interés, especialmente en el caso de tejidos embebidos en parafina tratados con sondas noisotópicas, además ayudan a remover proteínas que incrementan marcaciones de fondo indeseables (2, 7, 41, 42). Detergentes o ácidos. La hidrólisis con ácidos débiles y una incubación en una solución con detergentes aumentan el acceso de la sonda a las secuencias del ácido nucleico blanco (7, 43). La marcación de los ácidos nucleicos celulares por medio de HIS requiere una muy buena preservación de las moléculas blanco dentro del tejido permitiendo al mismo tiempo un máximo acceso de la sonda a las secuencias específicas que se buscan dentro de las células individuales; sin embargo, este proceso dificulta el acceso de la sonda al ácido nucleico, especialmente si el proceso de fijación es prolongado (21, 39, 44, 45). Prehibridización Para la HIS el material es prehibridizado incubándolo en un buffer de hibridización (que no contenga la sonda) durante una o dos horas a la temperatura de hibridización, con el fin de asegurar la penetración del tejido y bloquear los sitios de unión inespecíficos. La ventaja de este paso es que disminuye la marcación inespecífica y la desventaja es que disminuye la sensibilidad de la técnica (2, 7). Hibridización Al buffer de prehibridización se le adiciona la sonda marcada y se incuban las láminas en cámara húmeda para lograr la hibridización del ácido nucleico deseado con la sonda marcada. Para obtener un acoplamiento óptimo entre la sonda y la diana se precisan alrededor de una a dos horas para sondas biotiniladas o conjugadas con fluorocromos y hasta doce horas para sondas conjugadas con digoxigenina (51-53). Lavados poshibridización Los lavados después de la hibridización remueven la sonda que no se unió o que tiene uniones débiles con el ADN molde o con la mezcla de hibridización; generalmente, los lavados se realizan con la misma severidad de la hibridización. Cuando se utilizan oligonucleótidos los lavados deben ser suaves, ya que estas sondas son cortas y hay que asegurarse de que permanezcan hibridizadas al blanco (1, 2, 7, 37). Para la detección de los sitios de hibridización ARN o ADN en células, tejidos o embriones se prefieren sistemas cromogénicos mediados por enzimas que generan precipitados colorimétricos insolubles. Anticuerpos (o avidina), conjugados a una enzima, pueden unirse a la sonda marcada ya hibridizada, y luego incubarse con un sustrato cromogénico adecuado para la enzima. Comúnmente la enzima es la fosfatasa alcalina (PA) y se conjuga a la (estrepto) avidina, antidigoxigenina o antifluoresceína; y el sistema de detección que se usa es el NBT/BCIP (4-Nitroazul tetrazolio cloruro y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato). Marcadores radioisótopos Es la forma más tradicional de HIS por ser la más sensible; las desventajas de estas sondas incluyen una vida media corta, peligro biológico, y el hecho de que toman un largo tiempo en el proceso para obtener resultados (1, 7, 27-30). Digoxigenina: esteroide que se encuentra exclusivamente en las flores y hojas de ciertas plantas

12 Ejercicios

13 Ejercicio 1 Controles Tratados Hormona 1 Hormona 2 Intactos (g)
Castrados (g) Hipófisis 12.9 10.1 9.8 13 Tiroides 250 245 Timo 475 480 Adrenal 40 100 95 42 Ves. Sem. 500 450 490 410 900 412 Testículos 3200 -- 3000 5700 Próstata 425 387 430 380 800 375 Peso Corp. 300 270 200 195 385 275

14 Ejercicio 1 Tratados Hormona 3 Hormona 4 Hormona 5 Hormona 6 10.2 10.1
Intactos (g) Castrados (g) Hipófisis 10.2 10.1 25 25.7 9.8 9.7 8 7.8 Tiroides 252 250 490 495 245 247 500 505 Timo 470 462 460 150 140 455 461 Adrenal 38 41 39 30 29 37 Ves. Sem. 1400 1200 480 450 475 440 445 Testículos 2400 -- 3150 3200 2790 Próstata 900 800 400 375 410 380 405 Peso Corporal 485 160 144 135 152