Ejemplo de un “insulator” con efecto bloqueador de enhancer

Presentación del tema: "Ejemplo de un “insulator” con efecto bloqueador de enhancer"— Transcripción de la presentación:

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2 Ejemplo de un “insulator” con efecto bloqueador de enhancer
Ejemplo de un “insulator” con efecto barrera y bloqueador de enhancer Ejemplo de “insulator” con efecto de barrera

3 Ensayo para medir la actividad bloqueante de enhancer

4 Construcción para medir efecto barrera

5 ENCODE: encyclopedia of DNA elements
Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF binding sites in the human genome Cell March 23; 128(6): 1231 ENCODE: encyclopedia of DNA elements Fibroblastos humanos- ChIP-chip contra CTCF Se encontraron sitios de binding CTCF. Comparación de los sitios de binding a CTCF en dos tipos de células Distancias de los sitios CTCF a los extremos 5’ de genes

6 Objetivo: estudiar la regulación epigenética del locus de las apolipoproteínas
ApoA1, ApoA4 y ApoA5 constituyentes HDL- ApoA3, constituyende VLDL Antecedentes: ● Experimentos de ChIP-chip encontraron unos sitios de unión a CTCF en el genoma humano . ● Muchos sitios CTCF se corresponden con el enriquecimiento en complejos de cohesina (RAD21), que median la cohesion de cromátidas hermanas en mitosis ● No se estudió si hay correlacion entre cohesina y CTCF en la actividad de los insulators

7 Distribucion de sitios enriquecidos en CTCF/Rad21 en el locus Apo
ChIP-chip en líneas celulares humanas Verificación por ChIP comprobación in vitro por gel shift Conclusión: hay tres sitios de unión a CTCF : AC1, AC2, AC3 (que unen tambien Rad21, y un sitio AR1 que si bien tiene secuencia de cierto renocimiento a CTCF no lo une, pero si une Rad21

8 Comprobación de la actividad bloqueante de enhancers de los AC1
Comprobación de la actividad bloqueante de enhancers de los AC1. AC2, AC3 y AR1 Conclusión: los AC son aislantes funcionales Bloquean un 40-60% la acción del enhancer C3 en una respuesta independiente de la orientacion Su efecto es mediado por la unión de CTCF Se descarta que tengan efecto de silenciador AR1 tiene un efecto bloqueante moderado

9 Efecto de HNFa sobre el enhancer y promotor de ApoA4
HNFa: principal regulador transcripcional hígado produce activación a traves del promotor y del C3E ChIP demuestra que está unido tanto al promotor como al C3E La expresión de HNFa en HeLa promueve la expresión de los genes APOA1/C3/A4/A5 y no la de los tres genes vecinos Por ChIP se demuestra que se une a los 4 promotores y al enhancer Por lo tanto los elementos AC2 y AC3 actúan como aislantes

10 CTCF y cohesinas están involucrados en el control transcripcional de la región APO
Células Hep3B: tratadas o no con siRNA contra CTCF o Rad21. Medición de niveles de mRNA de cada gen por RT-PCR Conclusiones: la deleción de CTCF/Rad21 afecta diferencialmente los genes dentro de AC2 y AR1 y los que estan fuera de esa región

11 CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma
Metodología: 3C, framentos BglII; frecuencia de ligación con el enhancer APOC3

12 CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma
Conclusión: los aislantes dependientes de CTCF y cohesinas mantienen la conformación global del locus APO

13 Localización espacial del locus
3C más resolutiva para resolver entre interacciones insulator-promotor; promotor-promotor, insulator-insulator Se usa otra enzima de restriccion MflI

14 Modelos para la actividad bloqueante de enhancers de los “insulators”

15 Un balance de actividades determina el limite de propagación de la cromatina

16 Mecanismo simplificado al mecanismo de propagación y de automantenimiento de la heterocromatina en S.pombe

17 Distribución de Swi6, H3-K9 met o H3-K4 met en el locus Mat al delecionar los elementos aislantes