Axón de jibia 7 de abril de 2008 Fisiologia General 2008, Clases, VoltageClamp.ppt.

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1 Axón de jibia 7 de abril de 2008 http://einstein.ciencias.uchile.cl http://einstein.ciencias.uchile.cl Fisiologia General 2008, Clases, VoltageClamp.ppt

2 Axón de jibia Electrodo que inyecta corriente Electrodos para medir el potencial Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón. V x (t) En cada punto del axón pasa algo diferente, esto complica el análisis, tratemos de simplificar eliminando la variable espacio

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4 Eliminando la variable espacio Alambre axial La placa de tierra asegura que la resistencia del medio externo sea muy chica. R o = 0 El alambre axial asegura que la resistencia del medio interno sea muy chica. R i = 0. ¿Qué valor toma la constante de espacio? VmVm Electrodo que mide potencial

5 Space clamp VmVm Generador de corriente El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana. A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo, esto simplifica el análisis. Desaparece la variable espacio (Space clamp).

6 Potencial de acción de membrana

7 Space clamp VmVm Generador de corriente OK para potencial de acción de membrana. Pero si queremos medir intensidad de corriente en función del voltaje tenemos un problema porque mientras esté circulado corriente por el electrodo de tierra no sabemos el potencial extracelular Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.

8 Space clamp VmVm Generador de corriente Ve

9 Medida de Vm Vi Ve

10 Medida de Vm Vi Ve R R 0 V -Vi Ver en einstein.ciencias.chile.cl Fisiologia General 2008, Lecturas, Circuitos con amplificadores operacionales.

11 Medida de Vm Vi (t) Ve (t) R R -Vi R R 0 V Vi -Ve R Vm ?

12 Current clamp Vm Generador de corriente Con este circuito puedo controlar la corriente y medir el potencial. Current clamp.

13 Vm Con este circuito puedo controlar el potencial. ¿Cómo podría medir la corriente? V comando El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

14 Vm Con este circuito puedo controlar el potencial y medir la intensidad de la corriente. Voltage clamp. V comando Rf -IRf Voltage clamp El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

15 Vm Con este circuito puedo controlar el potencial y medir la intensidad de la corriente. Voltage clamp. V comando Rf -IRf Voltage clamp El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

16 Extracelular Intracelular Vm RmRm VrVr CmCm ImIm IiIi ICIC VmVm Tiempo ImIm VrVr Voltage clamp de un circuito pasivo

17 VmVm Tiempo ImIm VrVr Voltage clamp de un circuito pasivo Extracelular Intracelular RmRm VrVr CmCm ImIm IiIi ICIC

18 VmVm Tiempo ImIm VrVr Eliminando la corriente capacitiva X X Extracelular Intracelular RmRm VrVr CmCm ImIm IiIi ICIC

19 VmVm V comando Rf V 0 = -I i Rf Voltage clamp, resta de la corriente capacitiva R R -V comando CmCm 0 V Ajustar hasta que se cancele la corriente capacitiva

20 I, mA/cm 2 t, ms Voltage clamp de un axón de jibia -60,8mV 0mV

21 FUGU es un plato japonés que se prepara con la carne del pez globo pufferfish (especies Takifugu, Lagocephalus, or Sphoeroides) o del pez puercoespín (género Diodon). Debido a que el pez globo es un letalmente venenoso si se prepara en forma incorrecta, el fugu es el plato más celebrado y famoso de la cocina japonesa.TakifuguLagocephalusSphoeroidesDiodon Reino:Animalia Filo:Chordata Subfilo:Vertebrata Clase:Actinopterygii Orden:Tetraodontiformes Familia:Tetraodontidae Género:Takifugu Abe, 1949 FUGU

22 Tetrodotoxin (anhydrotetrodotoxin 4-epitetrodotoxin, tetrodonic acid, TTX) es una neurotoxina sin un antídoto conocido. Bloquea los potenciales de acción en los nervios uniéndose a los canales de sodio rápidos de las membranbas celulares de los nervios. El Dr. Yoshizumi Tahara la aisló en 1909 y la llamó tetrodotoxina, nombre derivado de Tetraodontiformes, el orden al que pertenece el pez globo.Yoshizumi TaharaTetraodontiformes

23 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na Control TTX

24 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

25 Canales de potasio del axón de gigante de la jibia jibia. (Del lat. sepĭa, y este del gr. σηπ ί α). 1. f. Molusco cefalópodo dibranquial, decápodo, de cuerpo oval, con una aleta a cada lado. De los diez tentáculos, los dos más largos llevan ventosas sobre el extremo, mientras que los otros ocho las tienen en toda su longitud. En el dorso, cubierta por la piel, tiene una concha calcárea, blanda y ligera. Alcanza unos 30 cm de largo, abunda en los mares templados y es comestible. Real Academia Española © Todos los derechos reservados

26 Pulso -120 a 100 mV Vm

27 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? Vm, mV I K, mA cm -2

28 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? ? Vm, mV I K, mA cm -2 -39.1 mV G K = 43.4 mS cm -2 V K = -39.1 mV

29 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? ? Vm, mV I K, mA cm -2 -39.1 mV G K = 43.4 mS cm -2 V K = -39.1 mV

30 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? Vm, mV I K, mA cm -2

31 Estrategia para buscar el potencial de inversión V K. Sospecha: V K = -94 mV Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué? Porque los canales están cerrados a -94 mV. Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V. V m, mV IK, mA/cm 2

32 Prepulso constante Pulso de prueba variable Vm

33 V K = -73,4 mV

34 Sorpresa: El valor encontrado, -74 mV es menos negativo que el esperado según Nernst (-94mV). Explicación: Los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na. Tarea: Calcular G K /G Na para estos canales V K = -73,4 mV

35 V m, mV IK, mA/cm 2 V K =-73.4 mV

36 V m, mV IK, mA/cm 2

37 Prepulso -100 a 200 mV -100mV

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40 Los canales de K son tetrámeros. Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina. Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo Los sensores de potencial operan en forma independiente. El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos. Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo La probabilidad de encontrar un canal abierto es...n4n4

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43 V 0 = -46 mV z = 1.4

44 V 0 = -47 mV z = 1.8 Errores pesados por 1/n

45 V 0 = -48 mV z = 1.2 Errores pesados por n La curva n vs V m no se ajusta bien a una función de Boltzmann.

46 Cinética

47 Vm -140mV 0 mV -100mV

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49  = 1.8 ms

50  = 4.7 ms

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52   ms -1  n Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.

53 Ng k = 35.3 mS/cm 2 V K = -73,4 mV Descripción completa de los canales de K del axón de jibia nn nn

54 Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV. Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV. Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.