BASES MICROBIOLOGICAS DE LA TERAPÉUTICA Y LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA Máster en investigación médica, clínica y experimental FARMACOLOGIA INTRACELULAR.

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1 BASES MICROBIOLOGICAS DE LA TERAPÉUTICA Y LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA Máster en investigación médica, clínica y experimental FARMACOLOGIA INTRACELULAR DE ANTIMICROBIANOS Dra. Sofía Ballesta Mudarra

2 El objetivo del tratamiento antimicrobiano es concentrar en el lugar de la infección suficiente cantidad de antimicrobiano para inhibir o destruir al microorganismo En este sentido los parámetros PK/PD son predictivos del perfil farmacocinético; son parámetros que correlacionan la eficacia frente a infecciones extracelulares Para patógenos intracelulares, el lugar donde debe concentrarse el antimicrobiano es menos accesible. Farmacología intracelular

3 Relaciones microorganismos y huésped Intracelulares obligados. Adaptado a vivir exclusivamente en el interior de las células y necesitan estar en el interior de la célula para sobrevivir Intracelulares facultativos pueden residir tanto dentro como fuera. Intracelulares oportunistas

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5 Farmacología intracelular

6 Intracellular drug concentrations (review) Dollery, C.T. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 2013. Volumen 93, 263-266

7 Farmacología intracelular

8 Vida intracelular Células fagocíticas Células no fagocíticas (epiteliales) La actividad intracelular va a depender de muchos factores, entre ellos de donde se localice la bacteria y de donde se acumule el antimicrobiano La célula con antibiótico intracelular se convierte en un transportador fisiológico al lugar de la infección

9 Farmacología intracelular Factores de los que depende la penetración de los ATB en la cell Tipo de transporte que utilizan los ATB para entrar en la cell Localización intracelular de los ATB en la célula Elución del ATB desde el interior de la célula al medio extracelular Actividad intracelular del ATB Selección del ATB adecuado DISEÑO de moléculas nuevas

10 Farmacología intracelular Ci/Ce

11 Farmacología intracelular Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB LipofíliaP = coeficiente de reparto Betelactámicos = hidrófilos Quinolonas = moderadamente lipofílicas Peso Molecular <700 Da Capacidad de unión a proteinas Naturaleza acido-base de la molécula Ka; pKa

12 Farmacología intracelular Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB Naturaleza acido-base de la mólecula Betalactámicos (acidos orgánicos) Quinolonas (anfotéricas) Macrólidos (carácter básico)

13 Farmacología intracelular Mecanismo de penetración de ATB en la célula Moléculas Neutras Lipófilas <700 Da - Betalactámicos - Quinolonas Difusión pasiva

14 Endocitosis Moléculas (No neutras) Moléculas demasiados polares (<<700 Da) Moléculas demasiados voluminosas - Aminoglicosidos y - Glicopéptidos Farmacología intracelular Mecanismo de penetración de ATB en la célula

15 Farmacología intracelular Mecanismo de penetración de ATB en la célula Canales transportadores Activo pasivo Moléculas Análogos de sustratos endógenos transportables al interior de la célula Con o sin Energía - Quinolonas y - Betalactámicos

16 Farmacología intracelular Salida del ATB de la célula

17 Farmacología intracelular Penetración intracelular de los ATB antimicrobiano célula eucariota Aislamiento de células (PMN, Macrófagos, células epiteliales…) Incubación células + ATB Medir la concentración del ATB intracelular

18 Farmacología intracelular Penetración intracelular de los ATB I ncovenientes Mide antimicrobiano asociado a la célula (fracción lipídica, proteica) antibiótico intracelular ó unido a la superficie externa de la célula. parte del antibiótico intracelular puede salir al exterior en el proceso

19 Farmacología intracelular Penetración intracelular de los ATB Técnica cromatográfica VHPLC muy especifica IRequiere grandes volúmenes de células IAltas concentraciones de ATC Técnica radiométrica VMuy sensible y reproducible IATB marcados radiactivamente Técnica fluorométrica VMuy sensible y reproducible IATB con fluorescencia

20 Farmacología intracelular Caracterización de la penetración de ATB Caracterizacion del paso por difusión pasiva Viabilidad celular Temperaturas Saturación del proceso Modificación del pH extracelular Caracterizacion del transporte activo Inhibidores metabólicos Inhibidores de fuentes de energía ( NaCN, FNa, 2,4 dinitrofenol) Desacoplantes de potencial de membrana (ouabaína o CCCP) Ionóforos como el w-clorofenil hidrazona (CCP) Análogos del transporte Estimuladores celulares (PMA ) Caracterizacion del efflux Inhibidores de bombas Distintos tiempos de incubación

21 Farmacología intracelular Medida de la actividad intracelular 1.Medición de halos de inhibición del antibiótico del interior de las células 2. Medición de la reducción que se produce en la supervivencia intracelular de las bacterias bacterias antimicrobiano célula eucariota

22 Diseño de nuevas moléculas. Formulación de nuevos fármacos

23 Fluorquinolonas Activos intracelularmente frente a patógenos intracelulares como Micobacteria, Legionella spp, Streptococcus pneumoniae y Sthapylococcus aureus. Mecanismos de resistencia específicos asociados con mutaciones, principalmente en los genes gyr A y parC. UB-8902. Esta molécula se diseña con objeto de mejorar la actividad de ciprofloxacino y norfloxacino frente a cepas resistentes.

24 XR1R2R3R4R5R6 Ciprofloxacino NHC 3 H 5 HHHH- UB-8902 NC 3 H 5 HHHHMet

25 Objetivo Evaluar la penetración de UB-8902 en leucocitos polimorfonucleares hunanos (PMNs) Estudiar la actividad intracelular de UB-8902 frente a S. aureus con resistecia asociada con mutaciones en los genes gyr A o parC Strain Mutations gyrA Ser84gyrA Glu88grlA Ser80 5-61wild-type 5-61 G8wild-type mutant 5-61 M14wild-typemutant

26 Cinética de penetración y eflujo de UB-8902 Tras 20 minutos de incubación con concentración extracelular de 2 mg/mL se alcanzan concentraciones intracelulares de 13,5 mg/mL ( C/E=6.5 ). Tras cinco minutos de incubación en medio libre de antimicrobiano se libera el 70% del mismo desde el interior de los PMN.

27 PENETRACIÓN DE UB-8902 EN PMN Fluorquinolona s C/E UB-89026.5 Norfloxacino4.5 Lomefloxacino6.9 Ofloxacino6.6 Moxifloxacino10 Trovafloxacino10

28 La cantidad de UB-8902 asociado a PMNS se saturó a concentraciones > 50 mg/ML

29 Influencia de los factores ambientales

30 Efecto de los estímulos de membrana ConditionsC/E Control6.5 ± 0.8 2,4-Dinitrophenol 0.1 mM7.4 ± 1.1 Sodium cyanide 1.5 mM3.3 ± 1.4 a Sodium fluoride 1.5 mM5.6 ± 1.8 m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM 6.0 ± 1.2 PMA7.1 ± 0.8 S. aureus 5-617.1 ± 1.0 S. aureus 5-61 M146.9 ± 1.6 a p <0.05 compared with the control.

31 Conditions/ ValueUB 8902MoxifloxacinoDX 619TROVAFLOXOFX LVX Viable cells, 37ºC, pH 7’2 (control)6.5 ± 0.810 6.64.6 Viable cells, 4ºC= ↓* ↑* ↓* Dead cells, 37ºC==== ↓* EflujoRápido Saturabilidad [0-40 mg/L] No pH 6 ↑*↑* == ↑*↑ ↑ pH 8 ↓*↓* ↓* == 2,4-Dinitrophenol 0.1 mM====== Sodium fluoride 1.5 mM= ↓* ==== m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM= ↓* = Hidrofobicidad= Poco hidrofóbica =Muy Hidrofóbica= = PasivoActivoActivo/pasivoPasivo Activo /pasivo Activo /pasivo

32 Actividad Intracelular de UB-8902 Cepa Mutaciones CMI gyrA Ser84 gyrA Glu88grlA Ser80 UB 8902Ciprofloxacino 5-61 wild-type 0,06 5-61 G8 wild-type mutant0,58 5-61 M14 wild-typemutant 464 La actividad de UB892 comparada con ciprofloxacino se ve aumentada 16 veces

33 En la cepa salvaje, UB 8902 provocó una reducción significativa de la supervivencia intracelular con las tres concentraciones extracelulares ensayadas. En las cepas mutadas, solo produjo una reducción significativa de la supervivencia intracelular a con > 1 mg/mL, no apreciándose diferencias significativas entre ambos tipos de cepas * * * * * * *