Efecto de iones en la Pirazinamidasa recombinante de la cepa H37Rv de Mycobaterium tuberculosis Patricia Ferrer.

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1 Efecto de iones en la Pirazinamidasa recombinante de la cepa H37Rv de Mycobaterium tuberculosis Patricia Ferrer

2 H37Rv PirazinamidaPirazinamidasa Modo de acción Clonación, expresión y purificación Quelación Reactivación enzimática con iones solos Reactivación enzimática en combinación iónica Parámetros cinéticos

3 Marco general ¿Qué es la pirazinamida? nicotinamida pirazinamida ≈ Reducción del tratamiento de la TB de 9 a 6 meses

4 Marco general Modo de acción de la Pirazinamida * No tiene un blanco específico intracelular *Pseudo-NAD (vía de reciclaje) *Inhibición/feedback en síntesis de NAD Disrupción de la fuerza protón motriz y depleción de energía Función de transporte de membrana

5 Marco general Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis Nicotinamidasa 37% de identidad de seq con Pzase de Pyrococcus horikoshii 999 6 hojas beta 4 alfa hélices Sitio activo: D8, A134, C138 Sitio de coordinación: H51, H71, D49

6 Marco general Diagrama del sitio activo unido al Zn+2 (en PH999)

7 Marco general Mecanismo de hidrólisis de PZA por la PZAsa de Mycobacterium tuberculosis

8 Hipótesis La enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada, podría reactivarse e incluso llegar a aumentar su actividad en presencia del Zn +2 o de algún metal de transición gracias a su unión en el sitio de coordinación. Objetivos Encontrar el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada. Evaluar las consecuencias sobre la actividad enzimática frente a una interacción iónica en una misma reacción Determinar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv sin quelar (dejada a temperatura ambiente por 6 horas) Comparar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv quelada junto con los iones vs la enzima sin quelar

9 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Clonación y expresión pET28a:: His6-PncA (se adicionan 6 His al extremo COO- de la enzima) Escherichia coli Novablue cells BL21(DE3)pLysS cells expresión Caldo LB + KanamicinaIPTGCentrifugar Pellet en binding buffer (buffer fosfato 20mM. 0.5 NaCl, imidazol 20mM)

10 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Purificación de la enzima Células a -70ºC Sonicación Centrifugación Recuperación del sobrenadante Obtención del extracto crudo Cromatografía de afinidad Fracción soluble Columna His-Trap Lavados con buffer 40 mM imidazol Salida de la Pzasa con buffer 60 mM imidazol Análisis de fracciones por SDS-PAGE

11 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Purificación de la enzima SDS-PAGE Gel de las fracciones de la cromatografía Prueba de Bradford T10 T11 T12 T13 T14 M T15 T16 Concentración de fracciones Nuevo SDS-PAGE

12 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Quelación Pzase H37Rv Control Muestra quelada (qx) * 50mM Buffer fosfato pH 6.45 * Agua MQ * 50mM Buffer fosfato pH 6.45 * Agua MQ * EDTA 80 mM En incubación por 6 horas a T amb Lavar con buffer fosfato pH 6.45 (filtración, Amicon - membrana de ultrafiltración de 10 Kda) x 3 veces Prueba de Bradford

13 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Prueba de actividad cualitativa (método de Wayne)método de Wayne Enzima control y quelada (qx) 50 mM Buffer fosfato pH 6.45 Pirazinamida 20 mM Agua MQ Incubación por 3 min a 37ºC Añadir sulfato de amonio ferroso 20% Inmediatamente añadir 0.1M Buffer glicina pH 3.4 Diferencia en intensidad de color

14 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales ControlMuestra Quelada Enzima 3uM 50mM Buffer fosfato pH6.4 Agua MQ 20mM PZA ----Con o sin ión (0.1-1.5mM) ** ** según el metal

15 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Iones Fe 2 (SO 4 ) 3.H 2 O FeSO 4.7H 2 O CuCl 2.2H 2 O Cd(NO 3 ) 2.4H 2 O MgSO 4.7H 2 O CoSO 4.7H 2 O MnSO 4.H 2 O CaCl 2 Zn (NO 3 ) 2.6H 2 O Concentración óptima de cada metal Titulación

16 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales blanco control qx sin ión qx- Cd qx- Caqx- Coqx- Cu qx-F e+2qx- Fe+3qx-Mgqx-Mnqx-Zn ----- xxxxxxxxxxx Xxxxxxxxxxxx Xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx Pzasa Buf.PO4 Agua MQ ión Pza

17 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales blanco control qx sin ión qx- Cd qx- Caqx- Coqx- Cu qx-F e+2qx- Fe+3qx-Mgqx-Mnqx-Zn 2. Incubar las muestras por 30 minutos a 37ºC 1. Añadir sólo enzima, agua, buffer e ión (según el caso) 3. Añadir la Pza e incubar las muestras por 3 minutos a 37ºC 4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4

18 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales blanco control qx sin ión qx- Cd qx- Caqx- Coqx- Cu qx-F e+2qx- Fe+3qx-Mgqx-Mnqx-Zn T = 0T = 1T = 2T = 3T = 4T = 5T = 6T = 7T = 8T = 9T = 10T = 11 T = 3T = 4T = 5T = 6T = 7T = 8T = 9T = 10T = 11T = 12T = 13T = 14 333333333333 Tiempo Pza Tiempo de detener la rxn Tiempo de rxn /tubo

19 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales 4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4 5. Centrifugar las muestras por 10 minutos a 13 000 RPM 6. Colocar por duplicado un volumen de cada muestra en un placa (espectrofotómetro a 450nm) Prueba de actividad cuantitativa (método de Wayne) 7. Realizar prueba de Bradford de cada una de las muestras/rxn

20 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales

21 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales % recuperación = (Act con metal - actividad qx sin ión) / ( actividad de no qx – actividad qx sin ión) x 100

22 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Los metales que reactivan más a la enzima: Co > Mn > Zn > Cd

23 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones blanco control qx sin ión Qx Cd+Mn Qx Co+Zn Qx Co+Cd Qx Mn+Zn Qx Mn+Cd qx Zn+Cd Qx-CoQx-MnQx-ZnQx-Cd Pirazinamidasa Agua MQ Pirazinamida ---- [óptima de ión] / 2 ** ** [óptima] de ión Co, Mn, Cd = 1mM Zn = 1.5 mM ** [ión] en el experimento Co, Mn, Cd = 0.5mM Zn = 0.75 mM

24 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones

25 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones Por lo tanto: No habría sinergismo en ningún caso La interacción produciría en cambio una disminución de la actividad o se manifestaría como si se tratara del ión sólo

26 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>>Mn, Zn, Cd ??? ENZYME - The Enzyme Data Bank

27 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd???

28 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???

29 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???

30 ¿Cuál será el efecto en una interacción iónica? Habrá alguna relación entre la homeostasis iónica y el parasitismo intracelular? X +2 = Fe+2, Cu+2, Mn+2, Zn+2 Nramp2 homólogo de rata Simporter potones/cationes divalentes de amplia especificidad Fe+2 >> Zn+2, Mn+2, Cu+2, Co+2, Ni+2, Cd+2, Pb+2

31 ¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv? Cinética enzimática Kcat = nº de recambio

32 ¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv? Cinética enzimática

33 ¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv? Cinética enzimática de la H37Rv control 00.050.100.150.250.50125101520 Pirazinamidasa Buffer fosfato pH 6,4 Agua MQ [Pza] mM Incubación por 2 min a 37ºC Intervalo de adición de la droga 1 min Tiempo de reacción con la droga 1 minuto a 37ºC

34 ¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv? Cinética enzimática de la H37Rv control 1er experimento 2do experimento

35 ¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv? Cinética enzimática de la H37Rv control 1er experimento

36 ¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv? Cinética enzimática de la H37Rv control 2do experimento

37 Marco general Acción de la pirazinamidasa

38 Metabolismo de NAD NAD -glycohydrolase Nicotinamide- nucleotide adenylyltransferase NAD(+) synthase Nicotinamidase phosphorilase Marco general

39 Método de Wayne Sulfato de amonio ferroso Buffer glicina pH 3.4 ¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?

40 ¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2

41 ¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2

42 ¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2

43 ¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Iones[final en la rxn] mM Fe 2 (SO 4 ) 3.H 2 O0.1 FeSO 4.7H 2 O0.1 CuCl 2.2H 2 O0.1 Cd(NO 3 ) 2.4H 2 O1 MgSO 4.7H 2 O1 CoSO 4.7H 2 O1 MnSO 4.H 2 O1 CaCl 2 1 Zn (NO 3 ) 2.6H 2 O1.5

44 % rec = d / x 100 ¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima? Reactivación de la Pzasa usando metales Actividad Enz qx + iones No qx Qx sin ión Ión1Ión2 Ión3 d