Centro de Biología Molecular y Celular Estudios estructurales de los fragmentos amino terminal de los canales de potasio tipo Shaker B nativo (ShB) y mutado.

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1 Centro de Biología Molecular y Celular Estudios estructurales de los fragmentos amino terminal de los canales de potasio tipo Shaker B nativo (ShB) y mutado (ShBL7E)

2 Posible topología de los segmentos transmembrana de cada una de las subunidades de un canal de K + tipo Shaker.

3 OBJETIVOS 1.- Explicar la diferente capacidad funcional de los péptidos ShB y ShBL7E en términos estructurales, confrontándolos con una diana modelo que contenga elementos que imiten los sitios de unión de la bola inactivante en el canal. 2.- Postular un modelo estructural del péptido inactivante ShB cuando se encuentra unido a la diana modelo. 3.- Explorar la posible regulación de la actividad de estos péptidos, y consecuentemente de los canales de potasio que los contienen, a través de modificaciones post-traduccionales que introduzcan cambios semejantes a los que diferencian al péptido ShB del péptido mutante ShBL7E. 4.- Sintetizar y caracterizar adecuadamente un análogo fotoactivable del péptido ShB, diseñado para marcar covalentemente por fotoafinidad el sitio de la proteína canal al que se une la “bola” inactivante.

4 Longitud de onda (nm) 1 7 1 7 % TFE  220 [  ] M.R.M. x 10 -3 (grado. cm 2. dmol -1 ) AB Fig. 1: Espectros de dicroismo circular de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) tomados en H 2 O (1), TFE (7) y en mezclas H 2 O/ TFE.

5 170016501600170016501600 Número de onda, cm -1 AB Fig. 2: Espectros de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E tomados en distintos tampones acuosos: efecto de la fuerza iónica ( A ) y bandas componentes ( B ).

6 Temperatura, ºC Número de onda, cm -1 1700 16501600 1700 16501600 30456075 60 70 80 90 100 1633/1643 cm -1 (%) A B C Fig. 4: Efecto del colato 5 mM ( A ) y 20 mM ( B ) sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E. ShB presenta componentes de estructura , muy estables a la temperatura ( C ).

7 - 38.9 15 ShBL7E - 34 - 39 ShB ShB + Tripsina - 44 ShBL7E + Tripsina Tiempo (min) 30456075 0 Fig. 5: Cromatogramas de HPLC de los péptidos ShB y ShBL7E y los fragmentos resultantes de la hidrólisis con tripsina de estos.

8 Fig. 6: Efecto de la tripsina sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB ( A ) y ShBL7E ( B ) en presencia de vesículas de PG: pérdida de los componentes de estructura . Número de onda, cm -1 176016801600 A 176016801600 B Control Digestión tripsina Fragmento 1-14 purificado por HPLC

9 Fig. 7: Banda amida I del espectro de FTIR del péptido ShB en presencia de vesículas de PG en distintas situaciones experimentales: gran estabilidad de los componentes de estructura . 170016501600 Número de onda, cm -1 Control 100 mM EDTA 1 M NaCl 2 % n-octil-  - glucopiranósido

10 170016501600170016501600 pD=7.4pD=8.9 PA/PC PG/PC PA/PC PG/PC ShB ShBL7E G) E) C) A)B) D) F) H) 100% 90% 50% 30% Número de onda, cm -1 Fig. 10: La adopción de estructura  requiere una gran densidad de carga negativa superficial.

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13 Fig. 14: El péptido ShB estabiliza la forma dianiónica del PA.

14 Fig. 15: Inserción del péptido ShB en vesículas fosfolipídicas aniónicas. 2 4 6 2 4 6 0. 00. 10. 2 0. 3 0. 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 A B C Razón molar (péptido/lípido) 0.000.050.100.15 Razón molar (péptido/lípido) ShBL7E ShB  H/  H 0  H (Kcal/mol lípido) DMPG DMPA

15 Tabla II: Secuencia de aminoácidos de derivados del péptido ShB (con el extremo C-terminal amidado) y sus análogos marcados con una sonda fluorescente. # nombre del péptido grado de marcaje secuencia del péptido 15101520 1 ShB MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ 2 ShBL7E MAAVAGEYGLGEDRQHRKKQ 3 ShB-21C MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ C 4 ShBL7E-21C MAAVAGEYGLGEDRQHRKKQ C 5 ShB-21C-NBD 89 % MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ C-NBD 6 ShBL7E-21C-NBD 88 % MAAVAGEYGLGEDRQHRKKQ C-NBD 7 ShB-21C-Rho 76 % MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ C-Rho 8 ShBL7E-21C-Rho 73 % MAAVAGEYGLGEDRQHRKKQ C-Rho 9 ShB-21C-Pyr 75 % MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ C-Pyr 10 ShBL7E-21C-Pyr 94 % MAAVAGEYGLGEDRQHRKKQ C-Pyr

16 Fig. 16: La inserción del péptido ShB en la bicapa aniónica es dependiente del pH. 1 2 3 4 5 6 7 pH 5.06.07.08.0  H(Kcal/mol) DMPA DMPA + ShB DMPA + ShBL7E

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19 Fig. 25: El péptido ShB-ASIB es un análogo funcional del péptido ShB. + péptido ShBL7E + péptido ShBL7E-ASIB + péptido ShB + péptido ShB-ASIB ShB  4-46 Inactivación tipo-N Inactivación tipo-C 50 ms 500 ms ShB  4-46 + péptido ShBL7E + péptido ShBL7E-ASIB AB C

20 Fig. 30: El péptido ShBY8(P) se comporta estructuralmente como ShBL7E. 170016501600 PG 23 º C 70 º C 23 º C Número de onda, cm -1 170016501600 PA 23 º C 70 º C 23 º C Número de onda, cm -1 PC 170016501600 23 º C 70 º C 23 º C Número de onda, cm -1

21 Tabla III: Efecto de diferentes péptidos sobre el curso temporal de la activación e inactivación de corrientes de K + en canales ShB  6-46. La constante de activación (  1/2 ) se mide como el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de la amplitud máxima de la corriente a diferentes potenciales. El valor de la constante de inactivación (  ) se estima ajustando el tramo de disminución de la corriente a una función exponencial de caida simple. Media  desviación estándar (n). t 1/2 activación (ms) t 1/2 inactivación (ms) Péptido 0 mV Control (sin péptido) 5.63  1.12 (7)3.28  0.43 (8)2.32  0.21 (8)1300  160 (6) ShB 4.91  0.95 (5)3.17  0.39 (7)2.22  0.23 (6)215  48 (6) ShB-Y8(P) 5.87  1.03 (5)3.39  0.47 (5)2.38  0.36 (5)766  87 (6) ShB-Y8(P) (Quinasa Src) 5.65  0.89 (4)3.35  0.32 (4)2.17  0.29 (4)634  81 (5) -20 mV +20 mV

22 Fig. 32: El péptido ShBY8(P) presenta componentes de estructura  que dependen de la relación lípido-péptido. 170016001650 PA 170016001650 Razón molar ShB-Y8(P)/fosfolípido 0.13 0.06 0.03 23 ºC 70 ºC 22 ºC Número de onda, cm -1 PG

23 Fig. 33: El péptido ShBY8(P) no se inserta en vesículas fosfolipídicas. 0,000,040,080,12 2 3 4 5 6 7 0,000,040,080,12 2 3 4 5 6 7 Razón molar (péptido/PLs)  H(Kcal/mol lípido) DMPC DMPGDMPA Razón molar (péptido/PLs) 0,000,040,080,12 2 3 4 5 6 7 Péptido ShB-Y8(P) Razón molar (péptido/PLs) Péptido ShB Péptido ShB-Y8(P) Péptido ShB Péptido ShB-Y8(P) Péptido ShB  H(Kcal/mol lípido)

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