Bioquímica Experimental

Presentación del tema: "Bioquímica Experimental"— Transcripción de la presentación:

1 Bioquímica Experimental
E. coli para la clonación de DNA y expresión de proteína recombinante. Semestre 2015-II 17 de marzo de 2015

2 Se desconoce el locus exacto
Nomenclatura Por convención en el genotipo solo se indican los genes mutantes, sin embargo los símbolos “-” y “+” (superíndice) se usan redundantemente para enfatizar un locus silvestre. Los Fenotipos se indican en mayúscula y son seguidos por un superíndice “+” o “-”, y algunas veces “r” (resistente) o “s” (sensible) Mutación en un locus conocido o desconocido rpsL (Strr) Mutación en el gen que codifica para la proteína ribosomal S12. Resistencia a estreptomicina. hsdR17 arg-3 Mutación lugar específica Se desconoce el locus exacto

3 Nomenclatura Una mutación amber es indicada como am y una mutación sensible a la temperatura se denota como ts. Una mutación constitutiva se indica con un superíndice q Las deleciones son indicadas con Δ Las inserciones se indican con :: Expresión constitutiva del gen que codifica para el represor lac. lacIq Los genes entre lac y pro también están deletados. Δ (lac-pro) trpC22::Tn10 Sitio de la inserción DNA insertado

4 Nomenclatura Φ (ompC’-lacZ+) Thus,zgh::Tn10
La posición de la inserción en el mapa se puede indicar por un código de tres letras. Una fusión se indica con el símbolo Φ seguido de los genes fusionados dentro de un paréntesis. F+, y Hfr son indicados al principio del genotipo, si la cepa es F’ entonces esto es indicado al final del genotipo con los genes llevados por el plásmido F listados en corchetes. Plásmidos y fagos lisogénicos llevados por la cepa, son mencionados en paréntesis al final del genotipo. Thus,zgh::Tn10 Siempre es z Intervalos de 1 minuto (letras a-i) Intervalos de 10 minutos Deleción en 3’ Indica un operon Φ (ompC’-lacZ+)

5 Propiedades generales de los hospederos para clonación
1.- Auxotrofia 2.- Mutaciones supresoras: Existen vectores que contienen mutaciones sin sentido en genes esenciales como medida preventiva para evitar su propagación a poblaciones naturales de bacterias. 3.- Sistemas de restricción modificación: Previene el intercambio genético entre grupos de bacterias permitiendo al hospedero reconocer y destruir DNA foráneo.

6 Propiedades generales de los hospederos para clonación
Metilación Dam y Dcm. La mayoría de cepas usadas para clonación son Dam+ y Dcm+. Cepas que son recA-, siempre son dam+ GATC CC(A/T)GG El genotipo recA- dam- es letal.

7 Propiedades generales de los hospederos para clonación
La presencia de Dam o Dcm puede afectar la eficiencia de transformación para un plásmido. Las cepas con mutaciones en Dam- Dcm son mutagénicas. Sistema EcoK Modifica el residuo de adenina (AACN6GTGC) Esta codificado por el locus hsdRMS (hsdR codifica para la nucleasa, hsdM codifica para la metilasa y hsdS la subunidad de reconocimiento) Cepas utilizadas para clonación generalmente son hsdR- (rK- mK+) o hsdS- (rK- mK-) E. Coli dam- DNAmet Ventaja: Transformación eficiente de DNA generado por PCR

8 Propiedades generales de los hospederos para clonación
Sistemas de restricción dependientes de metilación McrA, McrBC, y Mrr. McrA y McrBC cortan metilcitocinas en las secuencias CG y (A/C)G respectivamente, Mrr corta metiladeninas. McrA-, McrBC-, o Mrr-. 4.- Recombinación Los sistemas de recombinación del hospedero pueden catalizar el rearreglo del DNA recombinante. Mutaciones en el hospedero que suprimen la recombinación, pueden ayudar a mantener la integridad del DNA clonado RecA- Ventaja: Permite la clonación de DNA altamente metilado Ventaja: Incrementa la estabilidad del DNA plasmídico.

9 Propiedades generales de los hospederos para clonación
5.- α-complementación; Δ(lac-proAB) complementado con lacZΔM15 presente en el profago Φ80 o el plásmido ´F’

10 Hospederos para clonación
endA1: mutación en una endonucleasa inespecífica Ventaja: Mejora el rendimiento y la calidad del plásmido obtenido. gal E: Bloquea la producción de UDP glucosa, esto provoca que los lipopolisacáridos de membrana estén truncos, lo cual facilita la entrada de DNA. TOP10= DH10B+ Resistencia a estreptomicina

11 Propiedades generales de los hospederos para expresión
1.- Represores Los promotores, lac, lacUV5 y tac (comúnmente utilizados para regular la expresión en el vector) requieren al represor lacIq. Plásmidos con alto número de copia requieren que lacIq sea suplido en trans en un plásmido compatible. lacY: Previene el transporte activo de IPTG Sistema basado en la RNApol T7 La síntesis de la RNApol es regulada por el promotor lacUV5 (inducible por IPTG), ésta se encuentra en trans del lisógeno λ(DE3). Plásmidos pLysS o pLysE, expresan la lizosima T7 Ventaja: El IPTG entra a la célula dependiendo de su concentración; la proteína recombinante se expresa uniformemente en todas las células. Ventaja: Control muy astringente de la expresión (Proteínas tóxicas)

12 Propiedades generales de los hospederos para expresión
2.- Estabilidad Proteasas Ion: mutación en la secuencia que Codifica para la proteasa mayoritaria dependiente de ATP en E. coli. rpoH: disminuye la velocidad con que se degradan las proteínas OmpT: Deficiencia de una proteasa de la membrana externa RNAsa rne: abate la actividad de la RNAsa E Ventaja: Purificación de proteína recombinante intacta Ventaja: Incrementa la disponibilidad de mRNA para la traducción

13 Propiedades generales de los hospederos para expresión
3.- Uso de codones La frecuencia de utilización de codones varia entre organismos; los genes que contienen una alta proporción de codones raros casi no son expresados. Existen cepas de E. coli que contienen plásmidos con copias extras de tRNAs raros, particularmente argU (AGA/AGG), ileY (AUA), glyT (GGA), leuW (CUA), y proL (CCC) 4.- Solubilidad DnaK-DnaJ y GroES-GroEL ayudan a E. coli (silvestre) a plegar proteínas correctamente; existe evidencia que la co-sobrexpresión aumenta la proporción de proteína soluble. trxB y gor (los cuales codifican para una tioredoxina y glutatión reductasa respectivamente) facilitan la formación de puentes disulfuro. Ventaja: Permiten la expresión de genes provenientes de genomas ricos AT o GC. Ventaja: Útiles cuando la producción de proteína soluble depende de una oxidación adecuada.

14 Hospederos para expresión

15 Referencia Methods in Molecular Biology, Vol. 235:E. coli Plasmid Vectors Edited by: N. Casali and A. Preston © Humana Press Inc., Totowa, NJ