Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014

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1 Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014
Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014

2 Introducción RT-PCR Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentes
Quimioteca de compuestos catiónicos Ensayos de intercalación Intercalantes de ADN Ensayos de selectividad de secuencia Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentes Bases estructurales de selectividad Sondas de ADN RT-PCR Tinción celular Ensayos de actividad antiproliferativa Potencial antitumoral

3 Introducción Quinolizinio Sistemas tri , tetra y pentacíclicos
Variación de forma y tamaño

4 Síntesis Condensación de Westphal
Westphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm. 1961, 294, J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero, Org. Lettt. 2006,

5 Síntesis Metátesis de cierre de anillo Grubbs 2º generación
Hoveyda-Grubbs Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009 A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006

6 Ensayo de selectividad Quimioteca de compuestos catiónicos
Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Curvas de fusión Oligonucleótidos de secuencia definida Ligando unido: aumento de temperatura de fusión Intercalantes de ADN Ensayo de selectividad de secuencia ADN (preferencia AT vs GC) Ensayo de Intercalación con el ADN Selectividad vs estructura Quimioteca de compuestos catiónicos V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo  A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling  Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES , 2010

7 Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN
Curvas de fusión Oligonucleótidos de secuencia definida Ligando unido: aumento de temperatura de fusión V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo  A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling  Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES , 2010

8 Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Unión ADN
Selectividad GC ó AT 1 No --- 2 Sí AT 3 Muy débil No existe 4 5 6 Unión ADN Selectividad GC ó AT 7 No --- 8 9 Débil AT 10 11 Muy débil 12 Sí

9 Ensayos Fluorescencia: Máx. emisión Eficiencia cuántica 1 442 0,33 2
544 < 0,05 3 464 4 461 0,14 5 361 0,23 6 467 0,15 Máx. emisión Eficiencia cuántica 7 353 0,18 8 437 < 0,05 9 419 0,15 10 400 0,35 11 398 0,31 12 450 0,25

10 Ensayos 6 12 1

11 Valoración Fluorescencia
Materiales Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M) Procedimiento Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo Tiempo de intercalación: 10 min Error correspondiente a dilución menor del 5% Ratio 1:12 cromóforo/DNA

12 Valoración Fluorescencia
Gráficas 12 1

13 Valoración Fluorescencia
12 Gráficas Área bajo la curva Anisotropía de fluorescencia Constante de unión al DNA Kb= (6.92.6) 104 M-1 Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3 1

14 Dicroísmo circular inducido
Luz polarizada en un plano Plano formado por 2 componentes en fase Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría Cercanía en el espacio Molécula capaz absorber

15 Dicroísmo circular inducido
Gráficas Señal correspondiente al apilamiento de bases y a helicidad. CD aumenta en presencia de cromóforo Este cambio sugiere intercalación

16 Dicroísmo circular inducido
Gráficas

17 Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
Dyes and pigments 96 (2013)

18 Nuevos cromóforos Dyes and pigments 96 (2013)

19 Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

20 Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

21 Nuevos cromóforos Perspectivas Cromóforos funcionalizados
Compuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA

22 Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS

23 Híbrido de Losartán Introducción Objetivo Losartán Inhibidor de RAS
Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona ARAII Inhibidor de RAS Proteína reguladora Proteína G monomérica Activación y proliferación Objetivo Estrategia

24 Híbrido de Losartán Síntesis del inhibidor de RAS
J. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850

25 Híbrido de Losartán Oxidación de Losartán
A. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001)

26 Híbrido de Losartán Síntesis del Híbrido
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

27 Híbrido de Losartán Desprotección del Híbrido
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

28 Híbrido de Losartán Perspectivas
Desprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% Se evita la deshalogenación. Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008