Dra EMMA GUERRERO HURTADO

Presentación del tema: "Dra EMMA GUERRERO HURTADO"— Transcripción de la presentación:

1 Dra EMMA GUERRERO HURTADO
CINETICA ENZIMATICA Dra EMMA GUERRERO HURTADO

2 CINETICA QUIMICA Cinética Química es aquella parte de la Química que se encarga de estudiar la velocidad de una Reacción Química y los factores que permiten su control. Se limita a : Reacciones Reversibles

3 CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS
Según el número de moléculas: A P A + B p A + B + C P

4 SEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓN R. Primer Orden: A P
V= -d A= K (A) dT R. Segundo Orden: A+ B P V= -dA = -dB ó + dP dT dT dT V= K (A) (B)

5 CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN
En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teória para explicar la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima, en función a la concentración del sustrato. La concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como función de [S]. La expresión de Michaelis-Menten Vo = Vmax [S] Km + [S]

6 M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema : Sacarosa Glucosa + Fructosa Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales a)(E) variable y (S) constante b)(E) constante y (S) variable invertasa agua

7 A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimática
Vo & (E) Vo (E)

8 B) Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de una reacción Vo 1/2 Vmax KM Sustrato (S)

9 = Constante de Michaelis -Menten
Se supone: E + S ES ES E + P KM = Constante de Michaelis -Menten Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reacción Vmax = Cuando el enzima se halla saturado

10 Como se relacionan Vmax, Km y Vo?
Observemos : * K K3 E + S ES E + P K K4 Que hay un solo sustrato Que la velocidad K4 se desprecia * Que la concentración del E es muy pequeña * Que la E puede estar como: E libre y ES * Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que K3, por lo que éste es limitante determina, o limita, la cantidad de producto formado

11 POR LO QUE... LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA: VO = K 3(ES) LA ECUACION RESULTANTE SERA: VO =Vmax.(S) (S) + Km Ecuac. Michaelis Menten

12 .-1) Cuando [S] es igual que Km:
La dependencia de la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuación de Michaelis-Menten como sigue: .-1) Cuando [S] es igual que Km: vo= Vmax*[S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = Vmax Km + [S] [S]+ [S] [S] 2) Km= K2 + K3/ K1 Si K2>> K Km =K2/K1 K m= (E) (S) K = (E) (S) (ES) ES)

13 SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA
Vmax= K3 (ET) # de recambio K3= número de moléculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada

14 NÚMERO DE RECAMBIO Carboxipeptidasa 102 Tripsina 102 a 103 Cinasas 103 Deshidrogenasas Transaminasas Anhidrasa carbonica 106 Superoxido dismutasa catalasa 107

15 DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL
Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S] Se factoriza 1 = Km * [S] vo Vmax [S] Vmax[S] Se simplifica: 1 = Km * vo Vmax [S] Vmax La ecuación de la recta es: y = a * x + b

16 La ecuación de la recta es:
y = a * x + b donde: y = y x = 1 Vo [S] El valor de Km puede ser hallado a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la intersección negativa de x.

17 y = a * x + b 1/Vmax -1/Km

18 INHIBICION ENZIMATICA
ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

19 INHIIBIDORES Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E + I EI ES + I ESI 2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E + I E’

20 INHIBICIÓN REVERSIBLE
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, IMPIDIENDO LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO: Inhibición Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO IMPIDE LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

21 Inhibición Competitiva S
ES E + P I Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor: [E] [I] Ki = [EI] EI Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato

22 Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

23 Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
1/Vmax -1/Km -1/(Km(1 + i/Ki))

24 Succinato deshidrogenasa
Inhibidores competitivos Succinato deshidrogenasa

25 Inhibidores competitivos como ánalogos estructurales del substrato

26 Inhibición No Competitiva
ES EI I S E + P ESI Inhibición No Competitiva El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

27 INHIBICION NO COMPETITIVA
E + I EI I + ES ESI

28 El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad.

29 DROGA USO TERAPEUTICO ENZIMA AFECTADA TIPO DE INHIBICION Lovastina Hipercolestero lemia HMGCoA reductasa Competitiva 5fluoroacil cancer Dihidrofolato reductasa competitiva alopurinol gota Xantino oxidasa irreversible cumadin anticoagulante Glutamilcar boxilasa captopril hipertensión ECA

30 concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)
- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción. - La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

31 Estado de transición Substrato Análogo de estado de transición

32 EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN LAS INTERACCIONES ENTRE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO SON ÓPTIMAS

33 E + I E’ INHIBICIÓN IRREVERSIBLE
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente E + I E’ El efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

34 Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

35 Reactivos de grupos -SH,
(a) Agentes alquilantes Yodoacetato (b) Compuestos insaturados N-Etil maleimida (NEM)

36 Reactivos de grupos -SH, 2
(c) Formadores de mercáptidos p-Hidroximercuribenzoato (d) Oxidantes Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

37 Organofosfóricos DFP: diisopropil - Actúan sobre enzimas serínicas
fluorofosfato - Actúan sobre enzimas serínicas - Únicamente sobre la Ser activa - Insecticidas: Parathion, Malathion - Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

38 Ligandos de coordinación de metales
Es el caso del ion cianuro, CN- Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior. Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

39 SUBSTRATOS SUICIDAS (Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola Tienen por tanto : (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

40 E + I EI EI* E’ + I* Modo de acción de los inhibidores suicidas 1 2 3
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional 2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

41 INHIBIDORES SUICIDAS, - SISTEMA DE LA b-LACTAMASA BACTERIANA
La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas, sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió- ticos b-lactámicos.

42 Penicilina (activa) b-Lactamasa Ác.peniciloico (inactivo)

43 Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas
semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida de la b-lactamasa, el ácido clavulánico b-Lactamasa Ác.clavulánico Esta molécula reacciona con la serina activa de la b-lactamasa, produciendo su inactivación

44 - SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL
Los estados depresivos, en general, están relacionados con un descenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos (dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del cerebro. Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC ). Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea como terapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos inhibidores suicidas de la MAO

45 Noradrenalina Monoamino oxidasa La MAO es una flavoproteína: tiene un grupo prostético flavínico (FAD) fundamental para la catálisis. Los inhibidores suicidas de la MAO inactivan al cofactor FAD. Dihidroxifenilglicol

46 N,N’ dimetil propargilamina (pargilina) Flavina Inhibición suicida de la MAO mediante Pargilina Flavina modificada

47 CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES
1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple Azahar: A +E AE A E + B AEB B+ E BE BE + A BEA

48 2) ORDENADA MALATO + NAD OXALACETATO + NADH. E-NAD-MALATO M.D

49 2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO ASPARTATO + OXOGLUTARATO OXALACETATO + GLUTAMATO 1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + Oxalacetato 2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + Glutamato

50 qué son las moléculas efectoras o moduladoras ?
Son moléculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) de la velocidad catalítica. No cambian la afinidad del enzima por el sustrato. Pueden ser el mismo sustrato denominado HOMOTROPICO o es otra sustancia al que se le conoce como HETEROTROPICO

51 1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato.
ES DIFERENTE A LAS ENZIMAS ANTES VISTAS? ¡SI!! PORQUE LOS E.A. PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE UNION DE LIGANDOS: 1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato. 2.- Las reguladoras (Centro Alostérico) a las que se unen las moléculas denominada efectores o moduladores.

52 ENZIMAS ALOSTERICAS S S EF EF CA C.ALOST. ENZIMA

53 CINETICA SIGMOIDEA La unión cooperativa de la primera molécula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad de unión de subsecuentes moléculas de sustrato a los otros sitios de unión: cooperatividad positiva

54 ENZIMAS ALOSTERICAS Enzimas susceptibles de ser modificadas por moléculas pequeñas.

55

56 ESTADO CONFORMACIONAL
Baja afinidad por el sustrato R Alta afinidad por el sustrato

57 MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS MODELO CONCERTADO:
RR TT RR

58 MODELO SECUENCIAL : RT TT + S + S RR