INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE TACAMBARO ING. EN INDUDSTRIAS ALIMENTARIAS MICROBIOLOGIA EQUIPO 1 AGUILAR TORRES LIZETH CINTHIA CRUZ CORTES GUADALUPE.

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1 INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE TACAMBARO ING. EN INDUDSTRIAS ALIMENTARIAS MICROBIOLOGIA EQUIPO 1 AGUILAR TORRES LIZETH CINTHIA CRUZ CORTES GUADALUPE MIRANDA ROMERO CELINDA VELASQUEZ CERVANTES OLGA LIDIA GALLEGOS GARCIA JOSE MANUEL MARTINEZ VILLALOBOS Q.F.B. EMILIANO BARAJAS TORRES

2 Efectos de las microondas sobre la sobrevivencia de algunas bacterias patógenas en comidas populares costarricenses

3 ¿Qué es un microondas? Un microondas es un aparato que trasforma la electricidad en ondas electromagnéticas de longitud de onda muy corta, o lo que es lo mismo, ondas que vibra con una velocidad de unos 2.450 millones de veces por segundo. El calentamiento se produce cuando las microondas, que vibran a esta velocidad vertiginosa, transmiten su movimiento a las moléculas de agua de los alimentos, elevando su temperatura. Así el agua se evapora y se produce la cocción.

4 Aunque el tratamiento térmico de alimentos con microondas se conoce desde finales de 1940, no fue hasta los años 60 cuando los microondas de uso doméstico adquirieron popularidad, en especial en EEUU, donde se empezaron a utilizar por primera vez. Las ventajas frente a los tratamientos convencionales son velocidad, limpieza, calentamiento selectivo del alimento, ausencia de contacto con superficies calientes, reducción de costes, mejora de la calidad y ahorro de energía.

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6 Una de las vías más frecuentes de transmisión de algunas enfermedades bacterianas es la ingesta de alimentos contaminados. Actualmente, el uso del horno de microondas para cocinar o calentar alimentos se ha popularizado bastante, debido a la rapidez en el calentamiento que brinda. Sin embargo, es importante evaluar ese efecto térmico en la sobrevivencia de bacterias potencialmente patógenas, que frecuentemente se involucran en brotes de origen alimentario

7 DesselMudget Aleixo Rosemberg y Bogl

8 Arroz con leche Torta de huevo con papa PICADILLO DE VAINICA

9 PREPARACION DE LOS INOCULOS DE CELULAS VEGETATIVAS Para la preparación del inoculo final, tanto de Salmonella spp. como de S. aureus, se tomó una asada de la cepa y se suspendió en 100 ml de caldo tripticasa soya (CTS). Las suspensiones fueron incubadas 24 horas a 37º C con el fin de obtener inóculos de una densidad aproximada de 10 6 - 10 8 células/ml, mediante la comparación con el estándar de McFarland.

10 Para la preparación de las células vegetativas de C. perfringens, se tomó una asada de la cepa que se puso a crecer en agar yema de huevo en anaerobiosis (Gas Pouch, BBL) durante 24 horas 35º C. luego se tomaron varias asadas y se resuspendieron en 10 ml de CTS.

11 es un coco grampositivo, aerobio o anaerobio, inmóvil, no esporulante, con actividad catalasa y coagulasa, que generalmente se dispone en racimos irregulares semejantes a los de uvas. El género Staphylococcus contiene al menos quince especies. Además de S. aureus, las especies S. epidermidis y S. saprophyticus también se asocian con enfermedades humanas.

12 forma comúnmente parte de la microflora humana, puede producir enfermedad mediante dos mecanismos distintos. Las infecciones basadas en la proliferación de los microorganismos son un problema significativo en hospitales y otros centros de salud.

13 El B. cereus se puso a esporular en agar yema de huevo (FDA 1995) 24 horas a 30º C y en aerobiosis, para posteriormente ser suspendido en CTS. Se realizó una tinción de esporas con el fin de cuantificar la cantidad de esporas presentes por campo, según la técnica de Vanderzant y Splittstoesser, 1992.

14 BACILLUS CEREUS Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo su hábitat natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y especias, entre otros alimentos

15 B. cereus puede producir dos enterotoxinas: la toxina diarreica y la toxina emética. Los síntomas de la toxiinfección tienen dos formas de presentación con presencia de diarrea, dolores abdominales y vómitos. Su período de incubación varía de 4 a 16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado.

16 Es un microorganismo gram positivo en los cultivos jóvenes y a medida que envejece puede verse como gram variable o gram negativo. Las esporas aparecen claras en la tinción de gram y verdes con la tinción de esporas estas pueden estar dentro de la pared bacteriana o puede deformar la pared. Las temperaturas de crecimiento: mínima están entre 15ºC a 20ºC y la máxima es entre 40ºC a 45ºC con una óptimo de 37ºC.

17  (tiempo de cocción: 24 minutos) Se inoculó el arroz crudo (2 tazas) con 50 ml de la suspensión de B. cereus y con 50 ml de la suspensión de S. aureus, con el fin de obtener cargas aproximadas de 10 6 y 10 7 UFC/g de cada bacteria. Se homogeneizó con Stomacher y se tomaron 25 g de la muestra con el fin de realizar un recuento inicial (1a. muestra). se tomó la segunda muestra después de cocinar el arroz 15 minutos en 100% de poder, la tercera después de 4 minutos en 100% de poder, la cuarta luego de agregar la mezcla de leches con vainilla y cocinar por 5 minutos a 40% de poder y la quinta luego de dejarlo reposar durante 5 minutos. En todas las tomas de muestra se realizó una medición de la temperatura interna.

18 Cada muestra de 25g fue suspendida en 225 ml de agua peptonada estéril (0.1%) y homogeneizada en Stomacher. Se prepararon diluciones decimales hasta 10 7, las cuales fueron tratadas siguiendo la técnica de Número Más Probable descrita por Vanderzant y Splittstoesser para cuantificar cada microorganismo.

19 a. Bacillus cereus se pre-enriqueció cada dilución, por triplicado, en caldo nutritivo incubado 48 horas a 37º C y se confirmó el crecimiento utilizando agar Manitol Yema de Huevo Polimixina (MYP) incubado 24 horas a 30º C. d. S. Aureus Se preenriqueció cada dilución, por triplicado, en tubos de CTS + 10% NaCl incubados 48 horas a 35º C. Se confirmó el crecimiento utilizando agar Baird Parker incubado 48 horas a 35º C.

20 Evaluación de la sobrevivencia de las bacterias: s.aureus y a. Bacillus cereus

21 1. Arroz con leche: En el cuadro 1 se muestra el NMP de S. aureus presente en el arroz con leche antes y después de aplicado el tratamiento térmico. La carga inicial promedio de S. aureus presente en el arroz después de inoculado fue de 8x10 5 NMP/g, y esta carga disminuyó a < 3 NMP/g luego de cocinarlo durante 19 minutos. En dicho período se alcanzó una temperatura interna de aproximadamente 93 o C. El NMP de B. cereus inoculado en el arroz con leche disminuye logarítmicamente a medida que aumentan el tiempo y la temperatura de cocción, no obstante, después de transcurridos los últimos 4 minutos de cocción y los 5 minutos de reposo, la población de microorganismo aumentó en 1 log.

22 TiempoTemperaturaNMP (minutos)( o C)S. aureus/g*B. cereus/g** 0708 x 10 5 4 x 10 4 15924 x 10 1 23 1993<3 2469<316 5 minutos reposo71<387

23 El análisis de los resultados de arroz con leche indican que el tratamiento térmico aplicado con microondas resulta adecuado para la eliminación del S. aureus, lo cual concuerda con los datos expuestos por Marriot, Price y Frazier, los cuales aseguran que es posible eliminar a esta bacteria de los alimentos al aplicar calor a temperaturas superiores a los 66º C durante 12 minutos como mínimo. Con respecto a Bacillus cereus, los datos obtenidos concuerdan con los resultados de Buono et al. quienes también señalan que las esporas de B. cereus no pueden ser destruidas en su totalidad en un horno de microondas de tipo casero, por el contrario, es capaz de estimular la germinación de las esporas hasta llegar a un aumento en el recuento final

24 Torta de huevo con papa Las cepas de microorganismos empleadas fueron las siguientes: Staphylococcus aureus aislada a partir de una muestra de queso blanco. Salmonella spp. aislada a partir de huevo de gallina.

25 Características generales Salmonella es el nombre del género de una bacteria móvil (con excepción de las bacterias S. gallinarum y S. pullorum que no son móviles), con forma de barra, no espongiforme y Gram negativa,. Está presente muy frecuentemente en los animales, especialmente en las aves y los porcinos. Entre las fuentes ambientales de este organismo se incluyen el agua, el suelo, los insectos, las superficies de las fábricas, las superficies de las cocinas, las heces fecales de los animales, las carnes crudas, el pollo crudo, los productos marinos crudos, entre otros.

26 Factores que afectan el crecimiento, muerte y/o sobrevivencia de salmonella Limites para el crecimiento de Salmonella cuando otras condiciones (por ej: temperatura, pH, aw) son óptimos

27 Preparación de los inóculos de células vegetativas: Para la preparación del inoculo final, tanto de Salmonella spp. como de S. aureus, se tomó una asada de la cepa y se suspendió en 100 ml de caldo tripticasa soya (CTS). Las suspensiones fueron incubadas 24 horas a 37º C con el fin de obtener inóculos de una densidad aproximada de 10 6 - 10 8 células/ml, mediante la comparación con el estándar de McFarland.

28 CALDO SOYA TRIPTICASEINA El Caldo Soya Tripticaseína es un medio utilizado para cultivar una amplia variedad de microorganismos. Formulado de acuerdo con la fórmula especificada en la Farmacopea XXIII USP y al Código de Regulación. El CTS provee un excelente soporte de crecimiento para una amplia variedad de microorganismos. Este medio es recomendado para el cultivo de Bruecellas y bajo condiciones de anaerobiosis, para el cultivo de Clostridios. Garrison y Hedgecook lo recomiendan para el cultivo de H. capsulatum. Adicionado de 6.5% de Cloruro de Sodio puede ser utilizado para el crecimiento selectivo de estreptococos del grupo D. Este medio es recomendado por la Farmacopea para procedimientos de pruebas de esterilidad en productos biológicos y farmacéuticos. Peptona de Caseína 17.0 Peptona de Soya 3.0 Cloruro de Sodio 5.0 Fosfato Dipotásico 2.5 Ph 7.3 ± 0.2

29 Preparación torta de huevo con papa. (tiempo de cocción: 23 minutos). A la mezcla de 6 claras de huevo, 3 papas medianas precocidas 4 minutos y ajo se le agregó 50 ml de la suspensión de Salmonella spp. y 50 ml de la suspensión de S. aureus. Luego de homogeneizar con Stomacher, se tomó una muestra para recuento final. Debido a que el tiempo de cocción de esta receta es continuo y no fraccionado, se realizó una modificación con el fin de poder obtener la curva de sobrevivencia. Se tomaron muestras y se midió la temperatura a los 0,4,8,12 y 16 minutos. Para cada tiempo se preparo la receta desde el inicio con el fin de no interrumpir el tratamiento térmico.

30 Cuantificación de los microorganismos Salmonella spp. Se pre enriqueció cada dilución, por triplicado, en caldo lactosado, luego de lo cual fue enriquecido selectivamente en caldo selenito cistina y caldo tetrationato. El plateo confirmatorio fue realizado en agar Hecktoen y agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) los cuales fueron incubados a 35º C por 24 horas. Se consideró positiva la presencia de esta bacteria cuando uno de los dos medios confirmatorios o ambos presentaron colonias típicas.

31 Cuantificación de los microorganismos S. Aureus Se pre enriqueció cada dilución, por triplicado, en tubos de CTS + 10% NaCl incubados 48 horas a 35º C. Se confirmó el crecimiento utilizando agar Baird Parker incubado 48 horas a 35º C.

32 Resultados: Torta de huevo con papa Se presentan los resultados del efecto del tiempo y la temperatura de cocción del horno de microondas sobre el NMP de Salmonella. y S. aureus. Aún cuando la torta de huevo se cocinó durante 16 minutos y se alcanzó una temperatura interna de 93º C, el tratamiento no fue suficiente para eliminar todas las células de Salmonella presentes. Por otro lado, el comportamiento de S. aureus es similar al que presentó en el arroz con leche. La carga inicial de esta bacteria se redujo de 7.4x106 a 10 NMP/g.

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34 Discusión Los resultados sobre la sobrevivencia de Salmonella spp. en la torta de huevo con papa coinciden con lo que afirman diversos autores, quienes indican que la cocción de los alimentos con microondas no constituye un método adecuado para eliminar por completo cargas altas de Salmonella. Aunque el número de células de Salmonella sobrevivientes detectado es bajo, la FDA lo considera peligroso, ya que se estima que una sola célula de Salmonella es potencialmente patógena para el hombre si se almacena a temperatura ambiente por un período de tiempo suficiente y se alcanzan poblaciones altas.

35 Con respecto a S. aureus, la torta de huevo con papa puede considerarse apta para consumo de acuerdo a la norma de Pascual, quien establece que los alimentos preparados cocinados deben tener < 100 UFC/g de S. aureus. Según lo establecido teóricamente, se esperaba que el inoculo inicial de Salmonella se redujera más rápido que el inoculo de S. aureus, pues este último es más termorresistente. Sin embargo, el comportamiento de ambas bacterias fue similar. El hecho de que la población de S. aureus se redujera al mismo tiempo que la población de Salmonella puede deberse a "efectos atérmicos".

36 Clostridium perfringens Características generales Clostridium perfringens es una bacteria anaeróbica (incapaz de crecer en la presencia de oxígeno), con forma de bastón, Gram- positiva y formadora de esporas. Está distribuida ampliamente en el medio ambiente y se encuentra frecuentemente en el intestino de los humanos así como también en el de varios animales domésticos y salvajes. Sus esporas sobreviven en el suelo, en los sedimentos y en las áreas sujetas a la polución fecal tanto humana como animal.

37 Preparación de los inóculos de células vegetativas Para la preparación de las células vegetativas de C. perfringens, se tomó una asada de la cepa que se puso a crecer en agar yema de huevo en anaerobiosis (Gas Pouch, BBL) durante 24 horas 35º C. luego se tomaron varias asadas y se resuspendieron en 10 ml de CTS.

38 Picadillo de vainicas. (tiempo de cocción: 17 minutos). La mezcla de carne (300 g), especias, vainicas (500 g) y tomate fue inoculada con 50 ml de la suspensión de B. cereus, 50 ml de la suspensión de esporas y 50 ml de formas vegetativas de C. perfringens y 50 ml de la supensión de Salmonella spp. Luego de homogeneizar con Stomacher, se tomaron 25 g con el fin de realizar un recuento inicial (1a. muestra). Se tomó la segunda muestra luego de cocinar la mezcla durante 6 minutos a 100% de poder. La tercera se tomó 8 minutos después (100% de poder) y la cuarta después de 3 minutos de reposo.

39 Cuantificación de los microorganismos b. C. perfringens Se prenriqueció cada dilución, por triplicado, en caldo de carne picada incubado a 46º C por 4-6 horas, y se confirmó el crecimiento mediante el rayado de los tubos que presentaron turbidez en agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS), incubado a 35º C por 24 horas en anaerobiosis.

40 Resultados: Picadillo de vainica con carne molida: En el cuadro 3 se presentan los resultados obtenidos con la Salmonella inoculada en el picadillo de vainica con carne molida al ser tratada en el horno de microondas. Como se puede observar, después de cocinar el picadillo durante 14 minutos a 100% de poder, se redujo la población de 10 6 NMP/g a 3.9x10 2 NMP/g, siguiendo un comportamiento similar a la población de Salmonella inoculada en la torta de huevo con papa.

41 Con respecto a las células vegetativas de C. perfringens, éstas mostraron una reducción de 4 logaritmos después de su tratamiento en el horno de microondas (cuadro 3). Por otro lado las formas esporuladas de C. perfringens y. cereus mostraron un comportamiento similar, dándose una disminución en el NMP de éstas al aumentar el tiempo y temperatura de cocción, pero luego el número se mantiene constante.

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43 Conclusión El comportamiento de las formas esporuladas de B. cereus coincide con el descrito por Buono et al. quienes afirman que la cocción de los alimentos con microondas no es capaz de destruir las esporas de este bacilo en su totalidad, sino por lo contrario, es capaz de estimular la germinación de las esporas hasta llegar a un aumento en el recuento final. Los resultados obtenidos permiten evidenciar que el efecto del horno de microondas sobre las bacterias depende en gran medida de la composición del alimento y del tipo de bacteria tratada, y que las temperaturas internas alcanzadas en los alimentos no garantizan la esterilización de los mismos.