Desarrollo metodológico y utilidad clínica de:

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1 PRUEBAS BIOQUIMICAS E INMUNOLÓGICAS EN LA EVALUACIÓN FUNCIONAL HORMONAL TIROIDEA
Desarrollo metodológico y utilidad clínica de: Tirotropina humana (hTSH) Tiroxina Total (TT4) y Triyodotironina total (TT3) Tiroxina libre (FT4) y Triyodotironina libre (FT3) Tiroglobulina (Tg) Autoanticuerpos tiroideos Tiroperoxidasa (TPOAb) Tiroglobulina (TgAb) Receptor de hTSH (TRAb) REALIZADO POR: BR. OSKARINA LEON TOMADO DE: DE CATEDRA DE PATOLOGIA DE LA UNIVERSIDAD DE LA HABANA, CUBA AÑO 2007, PATOLOGIA DE LA TIROIDES Y UTILIDAD CLINICA DE PRUEBAS

2 GLANDULA TIROIDES FORMA ITSMO LOBULOS LATERALES

3 FISIOLOGIA TIROIDEA EJE HIPOTALAMO HIPOFISIARI O TIROIDEO

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5 REGULACION HORMONAL

6 COMPARACION T4-T3 T4 T3 PRODUCCION DIARIA 70-90 ug
LIBRE 0.05% LIBRE 0.4% VM 7-8 DIAS VM DIAS POOL EXTRATIROIDEO pgr 50pgr PLASMA 4 pgr/Kg 30% DE T4 EXTRATIROIDEO 6% DE T3 EXTRATIROIDEO TEJIDOS 70% TEJIDOS 94% MENOR AFINIDAD POR PROTEINAS DE TRANSPORTE Y MAYOR POR RECEPTORES TASA METABOLIZACION DIA 10% TASA METABOLIZACION DIA 75% AFINIDAD POR RECEPTOR 1 AFINIDAD POR RECEPTOR 10-20

7 DETERMINACIÓN DE TIROTROPINA HUMANA EN SUERO
DESARROLLO HISTORICO DE LOS METODOS 1960s: Radioinmunoensayo (RIA) ra Generación (SF: mUI/L) 1980s: Ensayos inmunométricos (IMAs, “sandwich”, no competitivos) 1984 : inmunorradiométricos (IRMAs) inmunoenzimométricos (IEMAs) 1989: inmunofluorimétricos (IFMAs) inmunoluminométricos (ILMAs) inmunoquimioluminométricos (ICMAs) inmunobioluminométrico (IBMAs) inmunoelectroquimioluminométricos (IECMAs) ELISA 2da Generación SF: 0,1 – 0,2 mUI/L 3ra Generación (SF: 0,01- 0,02 mUI/L) Actualidad RIAs IRMAs/IEMAs IFMAs/ILMAs ELISA Automatización IEMAS

8 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE hTSH EN SUERO
Pacientes ambulatorios con eje hipotálamo/hipófisis/tiroides intacto Exclusión de enfermedad tiroidea Pesquisaje de disfunción tiroidea (SF ≤ 0,02 mUI/L) estados de disfunción tiroidea primaria estados de disfunción tiroidea subclínica (prevalencia hipert ~2 % /hipot~10 %) población anciana (> 60 años) mujeres en edad fértil ( antes y durante el 1er trimestre de la gestación) Optimización de la terapia sustitutiva con Levotiroxina (L-T4) hTSH: 0,5-2 mUI/L Optimización de la terapia supresiva con Levotiroxina (L-T4) individualizado Estados de hipersecreción de TSH (hTSH ≈10 mUI/L / FT4/hipert. clínico) Evaluación de la función tiroidea durante la gestación Diagnóstico de disfunción tiroidea inducida por amiodarona Confirmación del diagnóstico diferencial entre hipertiroidismo y hipertiroxinemia disalbuminemia familial (FDH)

9 DETERMINACIÓN DE TIROXINA Y TRIYODOTIRONINA TOTALES EN SUERO
DESARROLLO METODOLÓGICO E HISTORICO : Yodo Unido a Proteína (PBI) 1960s: Ensayos de Unión Competitiva a Proteína (CPB) 1970s: Radioinmunoensayo (RIA, ensayo competitivo) Actualidad: Ensayos inmunométricos (IMAs, no isotópicos, automatizados) inmunoenzimométricos (IEMAs) inmunofluorimétricos (IFMAs) inmunoquimioluminométricos (ICMAs) espectrofotometría de masa

10 UTILIDAD CLÍNICA DE LAS DETERMINACIONES DE HORMONAS TIROIDEAS TOTALES
Evaluación de la función tiroidea en situaciones clínicas donde NO se presenten anomalías relativas a los niveles circulantes y afinidad de las proteínas transportadoras (TBG, TTR/TBPA, Albúmina) por las hormonas tiroideas EQUIVALENTE EXACTITUD DIAGNOSTICA TT4/TT3 VS FT4/FT3 Evaluación de la función tiroidea en estados clínicos asociados con alteraciones de los niveles circulantes las proteínas transportadoras y alteraciones moleculares de las mismas, fundamentalmente la TBG Ensayos adjuntos a la determinación de un estimado del estado de las proteínas transportadoras (FT4 I/FT3I) Evaluación de discordancia entre las determinaciones de hTSH y FT4 Evaluación de la función tiroidea en pacientes severamente enfermos hospitalizados en UCI TT4 TT3 Diagnóstico del hipertiroidismo clínico, fundamentalmente la Tirotoxicosis –T3

11 DETERMINACIÓN DE TIROXINA Y TRIYODOTIRONINA LIBRES EN SUERO
DESARROLLO METODOLÓGICO MÉTODOS DIRECTOS DE REFERENCIA 1950 – 1970: Métodos de Diálisis en Equilibrio Isotópico (DEI) : Método directo de FT4 (DEI+ RIA FT4) 1985: Diálisis en Equilibrio/Ultrafiltración/Adsorción a resina (dilución mínima) + T4 RIA sensible (picomoles T4) “ESTÁNDAR DE ORO” FUTURO: Ultrafiltración a 37ºC + Espectrofotometría de masa (filtrado)

12 DETERMINACIÓN DE TIROXINA Y TRIYODOTIRONINA LIBRES EN SUERO
DESARROLLO METODOLÓGICO MÉTODOS INDIRECTOS DE ESTIMADOS DE FRACCIÓN LIBRE (FT4E y FT3E) Métodos de índice (FT4 I y FT3 I) de dos ensayos con separación física Índice de FT4 por Diálisis Equilibrio Isotópico (DEI) x TT4 (PBI/RIA) Medición de TT4 + TBG inmunoensayo) TT4/TBG Medición de TT4 o TT3 + Ensayo de Captación de T3 o T4 (THBR) Ensayos de ligando sin separación física RIA de dos etapas RIA de una etapa (análogo marcado) Métodos inmunométricos (anticuerpo marcado, quimioluminiscencia)

13 UTILIDAD CLÍNICA DE LAS DETERMINACIONES DE HORMONAS TIROIDEAS LIBRES
MÉTODOS DE ESTIMADO DE LA FRACCIÓN LIBRE DE T4 (FT4E) Diagnóstico de disfunción tiroidea primaria clínica en pacientes ambulatorios Monitoreo del tratamiento en la fase aguda (< 3 meses) para el hipertiroidismo (ensayo óptimo) y en la fase crónica (> 3 meses, ensayo adjunto) Exclusión de hipotiroidismo (hipotalámico o pituitario) como ensayo óptimo Evaluación de la función tiroidea durante el embarazo y la terapia estrogénica

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15 UTILIDAD CLÍNICA DE LAS DETERMINACIONES DE HORMONAS TIROIDEAS LIBRES
MÉTODOS DE ESTIMADO DE LA FRACCIÓN LIBRE DE T3 (FT3E) FT3 + FT Diagnóstico de formas inusuales de hipertiroidismo y en ciertas condiciones raras: Indicador temprano de recurrencia del hipertiroidismo (BTD, ) después de suspendida la terapia con drogas antitiroideas TT3/TT4 puede ser usado para investigar el hipertiroidismo autoinmune/no autoinmune (> 0,024 molar sugiere estimulación tiroidea característica del BTD) Monitoreo de la respuesta aguda al tratamiento de la tirotoxicosis por BTD Indicación de hipertiroidismo inducido por amiodarona ( o normal) Bocio congénito (defecto en la organificación del yodo por defecto en TPO o defecto en la síntesis de Tiroglobulina) con [ T3] Indicador de predicción de tirotoxicosis inducida por yodo en pacientes con bocio multinodular de larga evolución ( [ T3])

16 UTILIDAD CLÍNICA DE LAS DETERMINACIONES DE HORMONAS TIROIDEAS LIBRES
MÉTODOS DE ESTIMADO DE LA FRACCIÓN LIBRE DE T3 (FT3E) Tumores pituitarios hipersecretores de TSH ( [ T3]) Síndromes de resistencia a hormonas tiroideas que usualmente se presentan sin hipertiroidismo clínico ( [T3]) Diagnóstico diferencial del hipertiroidismo subclínico (TSH / FT4 normal) de la tirotoxicosis por T3 Estudios de deficiencia de yodo caracterizada por T4 /T3 Establecimiento del grado de exceso de T3 durante la terapia supresiva con L-T4 Pacientes con bocio que viven en áreas con deficit de yodo deben realizarseles determinaciones de FT3 en adición a la determinación de TSH para detectar la tirotoxicosis por T3 causada por la autonomia tiroidea (focal o multifocal)

17 LÍMITACIONES DE LAS DETERMINACIONES DE HORMONAS TIROIDEAS LIBRES
Alta variabilidad en la exactitud diagnóstica entre métodos Pérdida de la exactitud diagnóstica en pacientes EUTIROIDEOS con anomalías extremas en la unión de las hormonas tiroideas a sus proteínas transportadoras (TBG, TTR/TBPA, albúmina) Situaciones clínicas más frecuentes Embarazo ( [TBG] [Alb]) Niños prematuros < 28 s. (diagnóstico de hipotiroxinemia) Anomalías genéticas de las proteínas de unión TBG (exceso, 3: ; o defecto, 1: congénitos) Albúmina (hipertiroxinemia-disalbuminemia-familiar, 1: 1000) Enfermedades No-tiroideas (NTI) Tirotoxicosis (FT3 no útil) Situaciones preanalíticas y analíticas autoanticuerpos contra T4 y T3 drogas que interfieren en la unión de las hormonas tiroideas a sus proteínas transportadoras (fenitoina, carbamazepina, furoseamida, aspirina) pacientes tratados con heparina

18 DETERMINACIÓN DE TIROGLOBULINA HUMANA (hTg) DESARROLLO METODOLÓGICO
Radioinmunoensayo (RIA) Ensayos Inmunorradiométricos Inmunorradiométricos (IRMA) Inmunoenzimométricos (IEMA) Inmunofluorimétricos (IFMA) Inmunoquimioluminométricos (ICMA) IRMAs RIAs IMAs No isotópicos Popularidad, dominio del mercado y automatización Interferencias por TgAb IMA > RIA Rapidez Amplio rango dinámico de trabajo Compuestos marcados más estables TgAb TgAb +

19 PROBLEMAS ANALÍTICOS- METODOLÓGICOS
DETERMINACIÓN DE TIROGLOBULINA HUMANA (hTg) PROBLEMAS ANALÍTICOS- METODOLÓGICOS Estandarización (matriz) Sensibilidad Precisión Efecto gancho (“Hook”) Interferencia TgAb (DTC 20 % vs Población 10 %, IMAs > RIAs) MUY ALTA variabilidad entre métodos RIAs vs IMAs Reestandarización de los métodos con un IRP, CRM-457 Directivas internacionales para evaluar sensibilidad funcional (CV 20%) y la imprecisión entre ensayos (<5 %) en meses (nueva determinación de muestras ya procesadas) Designación de diseños analíticos de dos etapas y ensayo de las muestras en dos condiciones (no diluida y diluida 1:10) No realización del ensayo de recobrado y si la discordancia entre RIA/IRMA RIA ≥ 2 ug/L, IMA NO det. (TgAb+: 100->1000 UI/ml)

20 Fig 7. Mean ± 2sd values for measuring 20 TgAb-negative normal sera by 10 different Tg methods. Method #1= Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX, USA; Method #2=University of Southern California RIA, Los Angeles, CA, USA; RIA #3= Kronus RIA, Boise ID, USA; Method #4= Endocrine Sciences RIA, Calabasas, CA, USA; Method #5=Nichols Institute Diagnostics ICMA, San Juan Capistrano, CA, USA; Method #6= Endocrine Sciences ICMA, Calabasas, CA, USA; Method #7=Sanofi Pasteur IRMA, Marnes-La-Coquette, France; Method #8=Kronus OptiQuant IRMA, Boise ID, USA; Method #9=Brahms DynoTest TgS IRMA, Berlin, Germany; Method #10=Diagnostic Products Immulite ICMA, Los Angeles, CA, USA. An asterisk denotes assays claiming CRM-457 standardization.

21 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE Tg
Masa de tejido tiroideo diferenciado presente Inflamación o daño de la glándula tiroidea que causan liberación de Tg Grado de estimulación de la glándula por vía del TSH-R

22 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE Tg
CÁNCER DIFERENCIADO DE TIROIDES (DTC) ≤ 0,5µg/L Tg hTSH < 0,1 mUI/L suprimida 1g tejido tiroideo normal RELACIÓN: masa tiroidea – Tg sérica – estado de TSH - paciente ≈ 1µg/L Tg hTSH normal 0,4 – 4 mUI/L 1g tejido tiroideo normal Determinación de Tg en la fase preoperatorio Determinación de Tg 1- 2 meses después de cirugía Determinación de Tg durante el monitoreo con L-T4/Rx Determinación de Tg bajo la estimulación con hTSH

23 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE Tg
Pacientes con TgAb negativo (TgAb método sensible, inmunoensayos) Un valor de Tg sérica en fase preoperatoria (tomado antes o > 15 d después de FNA) es útil para determinar la capacidad secretora de Tg del tumor Utilidad de la Tg como marcador tumoral post-operatorio (especialmente tumores ≤ 2 cm con Tg preoperatorio ) Fase post-operatoria (1-2 meses) la Tg refleja la efectividad de la cirugía y de la supresión de TSH por tratamiento inmediato con dosis supresivas de L-T4. Teniendo en cuenta que ~ 2gr de tejido remanante (Tg < 2 µg/L, tiroidectomías totales y 10 µg/L, lobectomías; TSH ≤ 0,1 mUI/L) NO hay un “intervalo de referencia”para pacientes con tiroidecto – mía total, los cuales no deben tener Tg detectable, aún si la TSH Cuando Tg es detectable durante la terapia con L-T4 (TSH<0,1mUI/L), cambios en la masa tumoral deben ser evaluados por determinaciones seriadas, sin suspender el tratamiento y sin aplicar estimulación con hTSH recombinante

24 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE Tg
Pacientes con TgAb negativo (método sensible, inmunoensayos) Cuando Tg es NO detectable durante el tratamiento con L-T4 y TgAb ausente (inmunoensayos sensibles), la determinación de Tg después de una estimulación con hTSH (preferiblemente por inyección intramuscular de hTSH recombinante) es más sensible que la determinación de Tg bajo supresión de TSH para detectar recurrencia o metástasis local (región cervical) del cáncer Respuesta secretora de Tg a la estimulación con TSHr exógena (tejido normal o tumor bien diferenciado Tg est. >3 veces la Tg b, pobre o no diferenciado Tg est. < 3 veces Tg basal (TSH <0,1mUI/L) Pacientes con TgAb positivo (TgAb método sensible, inmunoensayos) Típicamente muestran una respuesta moderada o no respuesta de Tg sérica a la estimulación de TSH Mediciones seriadas de TgAb (inmunoensayos sensibles) son de inestimable valor como un marcador tumoral indirecto de la presencia y progreso del tejido tiroideo tumoral

25 VALORES ESPERADOS DE TG RELATIVOS A LA MASA DE TEJIDO TIROIDEO Y AL ESTADO DE HTSH SÉRICA

26 DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS TIROIDEOS (TPO Ab, TgAb, TRAb)
AUTOANTICUERPOS CONTRA TIROPEROXIDASA (TPOAb) DESARROLLO METODOLÓGICO MÉTODOS CUALITATIVOS (Antígeno microsomal) Fijación de complemento Hemaglutinación pasiva (Eritrocitos de carnero) Inmunofluorescencia MÉTODOS CUANTITATIVOS (Autoantígeno TPO) Radioinmunoensayo (RIA) Ensayos inmunométricos (IMAs) IRMA EIMA IFMA Automatización ICMA E F I C N A TPO nativa MRC 66/387 TPOr

27 AUTOANTICUERPOS CONTRA TIROPEROXIDASA (TPOAb)
LÍMITACIONES METODOLÓGICAS alta variabilidad entre métodos (sensibilidad y especificidad) límites de detección de los ensayos (<0,3 a > 20 UI/ml) < 10 UI/ml Reportan valores no detectables en sujetos normales (TPOAb + patológico) > 10 UI/ml Reportan un rango normal (los niveles son normales o son problemas de inespecificidad) principios metodológicos TPO (pureza e isoformas)

28 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CONTRA TPO (TPOAb)
Diagnóstico de Enfermedad Tiroidea Autoinmune (AITD, > 95 % Tiroiditis de Hashimoto, % BTD): ensayo óptimo Factor de riesgo para Enfermedad Tiroidea Autoinmune (AITD) Factor de riesgo para hipotiroidismo durante la terapia con interferón alfa, interleucina 2 o litio Factor de riesgo para disfunción tiroidea durante la terapia con amiodarona Factor de riesgo de hipotiroidismo autoinmune en población > 60 años (pesquisaje TSH+ TPOAb) Factor de riesgo para hipotiroidismo en pacientes con Sindrome de Down (pesquisaje anual con TSH+TPOAb) Factor de riesgo de disfunción tiroidea durante el embarazo ( pesquisaje con TSH+TPOAb, 1er trimestre) y predictor de la tiroiditis posparto (1er-2do trimestre) Factor de riesgo de abortos y promotor de fallos en la concepción empleando técnicas de reproducción asistida (FIV)

29 TPOAb como un factor de riesgo para Enfermedad Tiroidea
Autoinmune (AITD)

30 DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS TIROIDEOS (TPO Ab, TgAb, TRAb)
AUTOANTICUERPOS CONTRA TIROGLOBULINA (TgAb) DESARROLLO METODOLÓGICO MÉTODOS CUALITATIVOS Hemaglutinación pasiva (Eritrocitos de carnero) Inmunofluorescencia MÉTODOS CUANTITATIVOS Radioinmunoensayo (RIA) Ensayos inmunométricos (IMAs) IRMA EIMA IFMA Automatización ICMA

31 AUTOANTICUERPOS CONTRA TIROGLOBULINA (TgAb)
LÍMITACIONES METODOLÓGICAS Alta variabilidad entre métodos (sensibilidad y especificidad) Principios metodológicos Estandarización Heterogeneidad de los TgAb Interferencia por Tg circulante Variables límites de detección de los ensayos (<0,3 a > 20UI/ml) < 10 UI/ml Sujetos normales < límite de detección del ensayo > 10 UI/ml Información de un intervalo de referencia ¿Importancia clínica de los niveles bajos de TgAb? Respuesta de anticuerpos por un incremento de la liberación del antígeno (Tg) producto de un daño a la glándula Anticuerpos “Naturales”

32 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CONTRA Tg(TgAb)
CONDICIONES CLÍNICAS NO-NEOPLÁSICAS Detección Enfermedad Tiroidea Autoinmune (AITD) en pacientes con bocio nodular que habitan en áreas con déficit de yodo. Monitoreo de la terapia con yodo para el bocio endémico

33 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CONTRA Tg(TgAb)
CÁNCER DIFERENCIADO DEL TIROIDES (células foliculares) TgAb COMO ENSAYO ADJUNTO A LA DETERMINACIÓN DE Tg TgAb debe ser realizado en cada muestra enviada al laboratorio para la determinación de Tg Determinaciones seriadas de TgAb es un indicador de la eficacia del tratamiento . Tienen valor pronóstico en el seguimiento y evaluación de la respuesta al tratamiento (recurrencia o no) en todos los pacientes con carcinoma diferenciado del tiroides TgAb +

34 DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS TIROIDEOS (TPO Ab, TgAb, TRAb)
AUTOANTICUERPOS CONTRA El RECEPTOR DE hTSH (TRAb) DESARROLLO METODOLÓGICO DE TBII Primera generación de ensayos 80 % Ensayo de radioreceptor (RRA) Segunda generación de ensayos ELISA Ensayo de tubo recubierto Ensayo TBII no isotópico (quimioluminiscencia) TSH-R porcino S E N I B L D A 98,8 % TSH-R adiposito de curiel TSH-R humano recombinante AUTOMATIZACIÓN

35 DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS TIROIDEOS (TPO Ab, TgAb, TRAb)
AUTOANTICUERPOS CONTRA El RECEPTOR DE hTSH (TRAb) DESARROLLO METODOLÓGICO DE TSAb/TSBAb Bioensayos “in vitro” de 1ra Generación Cortes de tejido tiroideo Células tiroideas (cultivo primario monocapa, / AMPc) Línea celular FRTL-5 (cultivo monocapa, / AMPc) Clonamiento del TSH-R humano (células CHO) hTSH-R r Bioensayos “in vitro” de 2da Generación Células CHO expresando hTSH-Rr (monocapa, / AMPc) Células CHO doble transfección (hTSH-R/Luciferaza-CRE, / luminiscencia)

36 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR DE hTSH (TRAb)
Diagnóstico diferencial de hipertiroidismo de causa autoinmune o no (tirotoxicosis facticia , tiroiditis sudaguda, tiroiditis posparto y bocio nodular tóxico} Factor predictivo de remisión clínica del BTD después de suspendida la terapia con ATS Predicción de riesgo de oftalmopatía (TAO) postratamiento con yodo radioactivo en pacientes con hipertiroidismo de causa autoinmune

37 UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR DE hTSH (TRAb)
Predicción de disfunción tiroidea fetal y neonatal en niños de mujeres embarazadas con una historia anterior o presente de AITD TRAb en embarazadas eutiroideas por previo tratamiento con ATS durante el 3er trimestre sugiere ser riesgo de disfunción tiroidea en el recién nacido (TSAb: hipertiroidismo neonatal, TSBAb: hipotiroidismo neonatal TRAb/TSAb en mujeres embarazadas eutiroideas (L-T4) quienes recibieron tratamiento con yodo radioactivo es indicativo de hipertiroidismo fetal (1er trimestre) o neonatal (3er trimestre) Mujeres embarazadas en tratamiento con ATS para el BTD deben ser analizadas por TRAb/TSAb/TSBAb en el 3er trimestre del embarazo. TRAb/TSAb/TSBAb indica evaluación clínica y bioquímica en el neonato al nacimiento (sangre del cordón umbilical y entre 4-7 días (sangre del talón del pie)