Introducción a la Espectrometría de Masa

Presentación del tema: "Introducción a la Espectrometría de Masa"— Transcripción de la presentación:

1 Introducción a la Espectrometría de Masa
Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en biología y biomedicina

2 Espectrometría de Masa
La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z). La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa. Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z). La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia……

3 Bioespectrometría Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones. Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.

4 Espectrometría de masa y Biología
Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas Ionización por “Electrospray” (ESI) para muestras líquidas

5 Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF
Espectrómetro de masa MALDI-TOF (Applied Biosystems Voyager DE-PRO) Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)

6 ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF
Camera Laser plate Pumping Beam guide Timed ion selector Reflector Linear detector Extraction grids

7 Analizador de masa TOF Aceleración post-irradiación láser Detector Región de deriva (Tubo de vuelo) +20 kV Iones de masas diferentes Click a second time – animation will show the pulse and the ions drifting at different rates. KE = ½ mv2 L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración . Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.

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9 Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina “in gel” de una proteína de membrana de 91 kDa. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

10 Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 98.90 13C 1.10 14N 99.634 15N 0.366 16O 99.762 17O 0.038 18O 0.200 31P 100.00 32S 95.02 33S 0.75 34S 4.21 36S 0.02 79Br 50.69 81Br 49.31

11 Resolución en MALDI-TOF
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

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14 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.
100 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z) 2093 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % Intensity Voyager Spec #1=>MC[BP = , 12005] 2xC13 C12 C13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= FWHM)

15 Algunas aplicaciones

16 CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA
Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

17 Espectro de masa del citocromo c de caballo
A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico 5000 7000 9000 11000 13000 15000 Mass (m/z) 6.0E+4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = , 60367]

18 Mapeo peptídico por EM (Peptide Mass Fingerprinting/MS)
proteína intacta péptidos enzima proteolítica MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT Basics of Peptide Mass Fingerprinting for the genomics audience. We start with a protein, it is cleaved at certain residues by a enzyme, the resulting peptide are then analyze by (single stage) MS. The group of peptides that are created from the protein form a signature for this protein we can use to search the protein databases. Each peptide is small subset of the protein sequence (see arrows in slide) Trypsin cleaves at R-X and K-X But usually don’t get complete sequence coverage

19 B. Molécula digerida con tripsina
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico 1000 1160 1320 1480 1640 1800 Mass (m/z) 2.0E+4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = , 19883] 163 3 . 8 2

20 medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental
RESUMEN: Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS. medida de masa de una molécula entera valor experimental medidas de masas en mapeo peptídico valores experimentales secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información

21 El Proteoma es dinámico
Estado metabólico Drogas Interacciones Proteína-Proteína Condiciones ambientales Proteoma Estrés Estadío de Desarrollo Control traduccional y post-traduccional mARN ADN Genoma Control transcripcional

22 Análisis por electroforesis 2D

23 Identificación de proteínas
Selección de la muestra Tratamiento con una enzima proteolítica Separación en gel 2D Búsqueda en banco de datos Extracción de péptidos y análisis de masas m/z 1000 1500 2000 Mass (m/z)

24 Protein Prospector Homepage MS-Fit Search

25 ProFound Search for Protein Identification Enzyme used for digestion
Set Kingdom Cys Modificatition (reduced, alkylated) Set Charge state

26 Search Result after Peptide Mass Fingerprinting
The result showed that in fact the spot contained 2 proteins. Both were identified, Vimentin and Tubulin. Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified. Note that the genome of CHO-cells (hamster) is not sequenced. Therefore the most homologues proteins of related species are scored.

27 Detailed Search Results View

28 Identificación de una proteína regulada por hierro en membrana externa de Sinorhizobium meliloti
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

29 Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µM FeCl3 (lanes 1 and 2), 500 µM EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µM EDDHA and 4 µM hemoglobin (lanes 5 and 6), or 500 µM EDDHA and 16 µM hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

30 FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

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32 Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

33 Identificación de proteínas por MALDI-TOF
Proteína aislada Proteína identificada por la masa de los péptidos (PMF), generados por un método específico: Enzimático o químico Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos La identificación es probabilística: según criterios estadísticos

34 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa
Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

35 Identificación de Proteínas de Células Huésped en
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Pureza/SDS-PAGE/ GCSF Pureza/HPLC/GCSF 36 29 24 20 14 A B B A

36 Identificación de Proteínas de Células Huésped en
materia prima del Factor G-CSF Da muestra A A B Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D). Electroforesis 2D de la materia prima

37 Identificación de Proteínas de Células Huésped en
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Digestión tríptica: muestra A Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN

38 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa
Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

39 Identificación de Modificaciones Postraduccionales
Fosforilación? NO2?

40 Common Protein Post-Translational Modifications
∆ (monoisotopic) modification -17 pyrrolidone carboxylic acid -2 disulfide formation (thiol oxidation) amidation 0.98 deamidation 2 disulfide reduction (thiol formation) 14 methylation 16 oxidation (e.g. sulfoxide formation) 28 formylation 42 acetylation 43 carbamylation 44 g-carboxyglutamic acid 71 Cys-propionamide sulfation phosphorylation Some modifications are natural. Many are the result of handling. disulfide vs. two thiols phosphate group vs. sulfate group good mass spectrometer needed especially with large molecules M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: (1999). Delta Mass at

41 Identificación de sitios de fosforilación
PknB de Mycobaterium tuberculosis 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

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43 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH
51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

44 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa
Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

45 2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES
pH B) pH Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente

46 Identificación de la proteína
ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Proteína Alternativamente, secuenciación de cada péptido Verificación de secuencia y detección de modificaciones postraduccionales .…MS/MS Espectrómetro de masa Mezcla de péptidos Enzima Masa de los péptidos Búsqueda en bancos de datos; Identificación de la proteína

47 seleccionado para MS/MS
Mezcla de péptidos 1 péptido seleccionado para MS/MS + MS/MS + + + + + Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Espectro MS

48 y ions b ions IV. Determining the amino acid sequence of a peptide.
By using tandem mass spectrometry, data specific to an individual peptide is collected. Fragmentation information can be used to determine the amino acid sequence of a peptide. Shown is the manner in which peptides fragment by the bonds that have been observed to dissociate. The most common fragment ions are the b and y-type ions, which provide overlapping information about the sequence.

49 By calculating the molecular weight difference between ions of the same type the sequence can be determined. The SEQUEST software, developed in the Yates laboratory, uses the fragmentation information of a tandem mass spectrum to search through the complete protein database of Sacchromyces cerevisiae to identify the sequence which best fits the fragmentation pattern. SEQUEST Performs sequencing and identification by matching unknown MS/MS spectra to sequence in a database Finds all peptides that matches the input masses. Calculates a preliminary score based upon matching ion intensities of predicted frament ions to peaks in the experimental spectrum. Calculates final scores by performing cross correlations of theoretical spectra of the top N preliminary scoring peptides against the input spectrum.

50 Del Genoma al Proteoma Funcionales Secuencia ADN Proteínas mARN
Control post-traduccional Control Transcripcional Control Traduccional Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN

51 Proyectos de Proteoma Humano
~>1,000,000 Proteinas Variantes ~40,000 Proteinas ~>5,000,000 Complejos?

52 APLICACIONES DE LA PROTEOMICA
Estudios de la funcion y organización Molecular de la celula Investigaciones en Fisiopatologia Predecir respuestas individuales a drogas Descubrimiento de nuevas actividades Biologicas y drogas Marcadores para diagnostico de enfermedades Estudio de modo de accion de drogas y toxicidad Descubrimiento de nuevas moleculas blanco de drogas

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58 4800 MALDI TOF/TOF™ Analyzer Schematic Sample Loading Chamber
Linear Detector 4800 MALDI TOF/TOF™ Analyzer Schematic 2-Stage Mirror Lens 3 Mirror Deflectors Metastable Suppressor Collision Cell Source 2 CID Lens (Lens 2) Decel Stack TIS Decel Deflectors Lamp Camera Laser Lens 1 X2,Y2 Deflectors Attenuator Reflector Detector X1,Y1 Deflectors Mirrors Source 1 Sample Loading Chamber Source 1 Lens Sample Plate and Stage

59 Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración. Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.

60 Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)

61 Time-of-Flight Mass Analyzer
Source Acceleration Detector Drift Region (Flight Tube) +20 kV Click a second time – animation will show the pulse and the ions drifting at different rates. KE = ½ mv2 Ions will separate according to their mass-to-charge ratios: light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions. The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio.

62 Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA). Datos técnicos:
- Laser de nitrógeno ( 337 nm) - Voltaje de aceleración: hasta  25 kV - Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector) - Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr) - Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa - Exactitud de masa : hasta % (20 ppm) - Sensibilidad (péptidos): subpicomolar Posibilidades de operación: Modo lineal Modo reflector "Delay extraction" (DE) "Post Source Decay“ (PSD) "Collision-Induced Dissociation“ (CID)