Book section V: Central dogma - from gene to protein

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2 Book section V: Central dogma - from gene to protein
Esta seccion cubre los capitulos q tratan de como fluye la información genetica en vias a ser expresada: Desde el nucleo donde es replicada, corregida, recombinada, expresada y regulada en su primera fase (transcripción) y procesada; luego es transportada el citoplasma donde es expresada en su segunda fase (traducción) y donde tambien es regulada Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

3 Chapters on the central dogma - from gene to protein
Chapter 15 Gene expression Chapter 16 Eukaryotic RNA processing Chapter 17 Protein synthesis & folding Expresion genetica - transcripion Procesamiento Traduccion Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

4 Al finalizar el estudiante podrá:
Objetivos Al finalizar el estudiante podrá: Conocer las diversas fases de la expresión génica. Conocer los tipos de factores de transcripción y su rol en la expresión génica. Entender la regulación de la expresión génica y las moléculas envueltas. Entender la relación entre los factores de transcripción y los procesos de transducción de señales.

5 Importante como y cuando se prenden o se apagan y como se controlan?
Niveles de control: a grandes rasgos Transcripcion,  traducción  Degradación de Proteinas transcripcion y los puntos de regulación transcripcional Factores de transcripción – proteínas que activan o desactivan genes al pegarse a secuencias especificas cercanas a las regiones codificantes Paradigma – operon de lactosa en E coli (procariotes) Eucariotes – 6% de los genes son factores de transcripcion Activan a las polimerasas de RNA (I, II, III) que son RPDD Regulación de estos factores es otra forma de controlar genes Síntesis de estos factores Transporte desde el citoplasma Modificaciones post traduccionales

6 The transcription cycle
Transcripción Iniciación RNA pol y promotor con factores Extension- enlaces fosfodiesttericos para unir nucleotios complementarios al templado’ Terminación – Disociacion del mRNA y luego del templado la pol queda libre Traducción Iniciación Extensión Terminación Fig. 15-1 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

7 Tipos de RNA producidos en células Tipo de RNA Función mRNA
Codifica para proteínas rRNA Ribosomas y síntesis de proteínas tRNA miRNA smaRNAs Adaptadores entre mRNA y aa en síntesis de proteína Regulación de expresión genética Splicing, telómeros, etc DIFERENCIAS ENTRE LAS DNA Y RNA POL Ribonucleotidos vs deoxiribonucleotidos RNA pol de novo vs DNA Pol need primer ( da as presicion al proceso de replicacion q al de transcripcion) Replicacion es para guardar info.. Es mas critico 10 a las 4 vs 10 a la 7 rate de error DNA vs RNA

8 Ciclo de Transcripción
Síntesis de RNA mensajero Iniciación RNA polimerasa localiza y se une al cromosoma. Complejo pre-iniciador Complejo abierto Extensión Razón de 20 a 30 nucleotidos/segundo Terminación RNA polimerasa se disocia del DNA Ciclo de transcripcion; 3 pasos: iniciación  alargamiento  terminación (15-1) Iniciación: varios pasos formación del complejo de preiniciación RNA polimerasa se localiza en una region promotora Interaccion bien especifica para distinguir region promotora de otras secuencias Formación de complejo abierto – cambio en conformación, se separan la doble hebra Esto da acceso al interior de la cadena para que lea Se forma enlace fosfodiesterico entre nucleotidos de una cadena compementarios a los de la otra cadena y salta!! Alargamiento: salto del primer par de pb hacia el proximo el alargamiento sigue hasta 30 nct/ seg hasta el final del gen Terminación: la polimerasa llega a una senal de terminación que causa una pausa en el alargamiento la secuencia naciente de RNA se disocia el DNA doble hebra se rehibridiza la RNA polimerasa se suelta y esta lista para buscar otro promotor donde la necesiten Cada punto de estos es un punto de regulación, el mas controlado y regulado es INICIACION.

9 Transcription units in prokaryotes & eukaryotes
Fig. 15-2 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

10 Ribosomal RNA transcription unit
Fig. 15-3 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

11 Región del DNA que regula la expresión del gen. Clasificación
Regiones Promotoras Región del DNA que regula la expresión del gen. Clasificación De acuerdo a su función Promotores fuertes Producto es abundante Promotores débilies Producto es raro o no abundante El nivel de expresión varia de célula a célula, depende de: las secuencias reguladoras Concentración de los factores de transcripción. Promotores de RNA Pols – la suma de secuencias de DNA necesarias para iniciar la transcripcion En eucariotas: Empaque de la cromatina reprime los promotores Proteínas activadores son requeridas para reclutar a la RNA pol En Procariotas: Ambos activadores y represores modulan la frecuencia de iniciación Promotores fuertes dirigen la síntesis de proteínas requeridas en abundancia Promoteres débiles para proteínas raraas y sus mRNAs Promotores son reconocidos por la interaccion directa entre DNA, RNA y sigma factor. El sigma factor mas conocido es el Sigma 70; reconoce dos secuencias de 6 bp localizados a 10 y a 35 bp “upstream” del start site de transcripcion (-10 y -35) Una vez iniciación ha ocurrido, Sigma ya no hace falta y se suelta y busca otra pol Hay variedad de sigmas para promover transcripcion de genes con función relacionada

12 Promotor de la Pol I (rRNA) Región que precede a los codones del gen.
Regiones Promotoras Promotor de la Pol I (rRNA) Región que precede a los codones del gen. 100 pares de bases antes del codón inicial. “core region” sobrelapa el codón inicial del gen. Promotor de la Pol II (mRNA y snRNA) Posee secuencias conservadas TATA Box TATAAAA 30 pb al frente de la secuencia iniciadora (TAC) Equivale al “Pribnow box” de los procariotas Región Iniciadora (menos conservada) En eucariotas: En Eucariotas: Promotores de pol I y pol II tamben están upstream del start Promotres para pol III contiene elementos promotores claves dentro de la secuencia Pol I reconoce upstream de un solo tipo de cada copia del arreglo en tamdem de pre-rRNA . FIg 15-5B. El elemento centra sobre lapa el sitio de start Cuenta con un sitio enhancer 100 bp upstream El promotoar para pol II contiene una secuencia consenso aproz -30 del start site 15.5-C – esta secuencia es TATAAA (TATA BOX) muy similar a la de bacterias en -10 Ademas del tata también esta el iniciador (upstream no tan consevado

13 15 pb a partir del terminal 5’, 3’ 5S rRNA C Box
Regiones Promotoras Promotor de la Pol III Dos tipos tRNA A Box B Box 15 pb a partir del terminal 5’, 3’ 5S rRNA C Box Centro de la región codificadora En eucariotas: Pol III tiene dos tipos de promotores Cada uno con key elements en las secuencias transcritas tRNA contiene dos elementos de 11 pb el A y el B centralizados a una 15 bp del terminal 5’ y el 3” de la se codificantes 5S tiene el C box localizado en el centro

14 Promoters in prokaryotes & eukaryotes
En eucariotas: Empaque de la cromatina reprime los promotores Proteínas activadores son requeridas para reclutar a la RNA pol En Procariotas: Ambos activadores y represores modulan la frecuencia de iniciación Promotores fuertes dirigen la síntesis de proteínas requeridas en abundancia Promoteres débiles para proteínas raraas y sus mRNAs Promotores son reconocidos por la interaccion directa entre DNA, RNA y sigma factor. El sigma factor mas conocido es el Sigma 70; reconoce dos secuencias de 6 bp localizados a 10 y a 35 bp “upstream” del start site de transcripcion (-10 y -35) Una vez iniciación ha ocurrido, Sigma ya no hace falta y se suelta y busca otra pol Hay variedad de sigmas para promover transcripcion de genes con función relacionada En Eucariotas: Promotores de pol I y pol II tamben están upstream del start Promotres para pol III contiene elementos promotores claves dentro de la secuencia Pol I reconoce upstream de un solo tipo de cada copia del arreglo en tamdem de pre-rRNA . FIg 15-5B. El elemento centra sobre lapa el sitio de start Cuenta con un sitio enhancer 100 bp upstream El promotoar para pol II contiene una secuencia consenso aproz -30 del start site 15.5-C – esta secuencia es TATAAA (TATA BOX) muy similar a la de bacterias en -10 Ademas del tata también esta el iniciador (upstream no tan consevado Pol III tiene dos tipos de promotores Cada uno con key elements en las secuencias transcritas tRNA contiene dos elementos de 11 pb el A y el B centralizados a una 15 bp del terminal 5’ y el 3” de la se codificantes 5S tiene el C box localizado en el centro Fig. 15-5 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

15 Punto principal de control 07_09_1_bacterial gene.jpg
Señales: Start/Stop Promotores (conserv) Punto principal de control 07_09_1_bacterial gene.jpg 07_09_1_bacterial gene.jpg SENALES EN EL DNA DICEN A LA RNA POL DONDE COMENZAR Y TERMINAR Iniciacion es el paso critico en la regulacion de expresion: q genes usar, para q proteina hacer y a q velocidad Para iniciar la RNA Pol debe ser capaz de reconocer el comienzo del gen y unirse a este firmemente EN BACTERIAS es mas simple: Choca con DNA, se desliza hasta encontrar promotor con el Start point Abre la doble hebra y una de las dos sirve de molde Dos son unidos para iniciar y sigue con alargamiento hasta encontrar otra senal de terminacion Alli se detiene y libera ambas cosas el templado y la cadena nueva Subunida de la Pol bacterial Sigma responsible por el reconocimiento del promotor Se suelta a los 10 nucleotidos polimerizados Y se recicla para el prox start Complejo Cerrado vs Abierto

16 Promotores y terminadores especificos son reconocidos por la RNA pol
07_09_2_bacterial gene.jpg 07_09_2_bacterial gene.jpg En procariotas hay promotores y terminadores que dicen donde comenzar y terminar y son reconocidos por la polimerasa La pol reconoce promotor aunq este en DS Ejemplos de promotores tipicos - verdes y de terminadores tipicos – rojos Numerso cuentan desde el 1er nucleotido transcripto q es +1 Asimetria por -10 y – 35 dtermina donde la pol se pega y en q direcion se movera para transcribir

17 Prokaryotic RNA polymerase
Protagonista de las reacciones Conservada Dependiente de factores de transcripcion (Sigma vs GTF) Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Fig. 15-6

18 genes : en cualquier dirección pues hay DS
Promotor asimétrico; -10 y -35 Dirección 5‘  3’ 07_10_transcr_DNA.jpg Que asegura que una porción de DNA X sera transcrita? 07_10_transcr_DNA.jpg Siempre se utiliza una hebra como templado La direccion es detrminada por la orientacion del promotor asimetricamente Lo q asegura transcripcion es la presencia de un promotor

19 Transcripción Eucariotes: Iniciación
Mas complejo el proceso que en procariotes. Difiere en : 3 polimerasas: RNApol I, II, III vs 1 polimerasa de RNA un factor de iniciacion (Sigma) vs muchos factores Genes a transcribirse no están cerca uno de otros, facilita el control individualizado por otras secuencias Presencia de nucleosoma, hay que desenredarlo

20 Factores de Transcripción
No. subunidades Peso Molecular de Subunidades Orden/Función TFIIA 3 12,19,35 Estabiliza unión de TBP y TATA (3) TFIIB 1 25 Selecciona sitio de iniciación Recluta la polimerasa II (4) TFIID 12 15-250 Interacciona con factores de (2) regulación TBP 38 Reconoce el “TATA Box” (1) TFIIE 2 34,57 Recluta TFIIH (7) TFIIF 30,74 Une Pol II y TFIIB (6) TFIIH 9 35-98 Desenrrolla el DNA del promotor (8) Pol II 10-220 Cataliza la síntesis de RNA (5) TOTAL 42 ~1,000 Generales GTFs Altamente conservados TATA Box –Binding Protein TFIID Tabla 15-1 Asignada Página 259

21 Factores de RNA Pol II - Iniciación
Formación del complejo preiniciador TFIID (TBP + TAFs) Se unen al “TATA Box” TFIIA Estabiliza el complejo TFIID-TATA Box Evita la unión de represores TFIIB Se une al TBP y DNA al frente y después del “TATA box” Determina el tamaño o distancia entre el “TATA box” y la secuencia iniciadora.

22 Factores de RNA Pol II RNA polimerasa II - TFIIF Estabiliza la interacción de la RNA Polimerasa II con el TFIIB y TBP El TFIIF previene que la RNA Polimerasa II se una a lugares no promotores TFIIE y TFIIH Estabiliza el complejo proteína y DNA E es estimulador de H TFIIH Helicasa 5’- 3’ y 3’ - 5’ Adenosina trifosfatasa dependiente de DNA Actividad de cinasa Reparar el DNA Mutado en Xeroderma pigmentosa

23 RNA polymerase II preinitiation complex
El montaje de los GTF en el promotor de eucariotes TFIID es el primero que se une al TATA (TBP) y lo distorsiona Esto atrae los demas factores al promotor TFIID con TBP TFIIA TFIIB la RNA POL con TFIIF TFIIE TFIIH – kinasa y fosforial a la RNA pol la q enteonces se suelta de los GTF y comienza a leer y polimerizar Complejo de iniciacion El orden varia entre promotores Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Fig. 15-7

24 El montaje del os GTF en el promotor de eucariotes
TFIID con TBP es el primero que se une al TATA y lo distorsiona Esto atrae los demas factores al promotor TFIIA TFIIB la RNA POL con TFIIF TFIIE y TFIIH – kinasa y fosforila a la RNA pol la q enteonces se suelta de los GTF y comienza a leer y polimerizar Complejo de iniciacion El orden varia entre promotores

25 Transcription is carried out by a large RNA polymerase II holoenzyme
Holoenzima es la pol y un complejo mediador (coactivador) Preiniciacion son los factores Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Fig. 15-8

26 07_07_RNApolymer.jpg 07_07_RNApolymer.jpg

27 Cataliza enlaces fosfodiester Desenreda la hélice 5’> 3’ rNTP
RNA Polimerasa Cataliza enlaces fosfodiester Desenreda la hélice 5’> 3’ rNTP Transcripto 1rio se libera inmediatamente Varias copias del mismo gen en poco tiempo

28 Tres sistemas de transcripción
Tres Polimerasas de RNA en Ecuariotas Tipo de Polimerasa Genes transcritos RNA Pol I Mayoría de los genes para rRNA RNA Pol II Genes estructurales codificantes, miRNA, spliceosoma RNA pol III tRNA 5s rRNA Otros smRNAs, pequeños Hay tres sistemas clásicos de transcripción RNA Pol I Upstream Binding factors RNA Pol II RNA Pol III Existen sistemas auxiliares de transcripción Requieren del uso de TBP aunque carecen de TATA Box en su promotor. Promotores de genes snRNA (small nuclear RNA) DIFERENCIAS ENTRE LAS DNA Y RNA POL Ribonucleotidos vs deoxiribonucleotidos RNA pol de novo vs DNA Pol need primer ( da as presicion al proceso de replicacion q al de transcripcion) Replicacion es para guardar info.. Es mas critico 10 a las 4 vs 10 a la 7 rate de error DNA vs RNA

29 Transcripción - Extensión
Comienza con el proceso de extensión Asociado a “promoter clearence” Cambios estructurales en la RNA polimerasa Regulado por factores de extensión Reacción general (NMP)n + NTP  (NMP)n+1 + PPi Complejo de extensión un balance entre estabilidad y flexibilidad La ultima parte de la iniciacion comienza con la limpieza del promotor y resultara en alargamiento o extension Salen los factore siniciadores y entran los de extension Estos factores alargan y prepararn para la lliberacion del complejo terciaro Reaccion general es q a un Polimero de NMPs se la anaden NTP y se libera PPI NMP es el polimero NTP es A, T ,C o G

30 Events during transcription elongation
Despues de anadir cada nuleotido la RNA Polimerasa posee cuatro opciones: Cual dependera de las interacciones entre el complejo de transcripcion, el templado, el transcripto naciente, y los factores reguladores Extender – extiende y extiende, no lo hace de continuo, lo hace se sobresaltos entre pausas Pausar – por bajas concentraciones de NTP o por falta de complementaridad entre el RNA nuevo y el templado mas largas por estructuras 2rias en el mRNA naciente, hibridos DNA/RNA Moverse en reversa – la no incorporacion de un NTP que afecta la complementaridad con el templado Terminar – cuando se transcriben poli Us…pausa larga asociada a terminar Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

31 Transcripción - Terminación
Mediada por factores de terminación Interaccionan con la RNA polimerasa Luego de cada adicion; la pol tiene cuatro opciones Extender - Pausar Reversa Terminar Extiende por grupos luego de pausar una vez comienza el primer enlace puede estar hasta por 17 hors y 2 millones de bp (distrofina) Pausas cortas por – baja en concentracion de NTP o por peq misspairing con el template Pausar largas por Estructuras secundarias o por hibridos DNA/RNA Despues de anadir cada nuleotido la RNA Polimerasa posee cuatro opciones: Cual? dependera de las interacciones entre el complejo de transcripcion, el templado, el transcripto naciente, y los factores reguladores Extender – extiende y extiende, no lo hace de continuo, lo hace se sobresaltos entre pausas Pausar – por bajas concentraciones de NTP o por falta de complementaridad entre el RNA nuevo y el templado mas largas por estructuras 2rias en el mRNA naciente, hibridos DNA/RNA Moverse en reversa – la no incorporacion de un NTP que afecta la complementaridad con el templado Terminar – cuando se transcriben poli Us…pausa larga asociada a terminar Terminacion hay senales especificas Despues de anadir cada nuleotido la RNA Polimerasa posee cuatro opciones: Cual dependera de las interacciones entre el complejo

32 Polimerasa I Polimerasa II Polimerasa III
Transcripción – Terminación – Eucariotas Desestabilizar el hibrido DNA/RNA Polimerasa I Proteína que interaccionan con secuencia downstream Polimerasa II Multiproteínas que reconocen el poly A Polimerasa III No requiere factores proteicos Transcribir U Mediada por secuncias especificas que provocan la liberacion del transcript y la disociacion de la pol

33 Mechanisms of transcription termination Prokaryotic
Terminacion en Procariota dos mecanismos: dependiente o independiente de RHO Rho independent Terminacion dirigida por secuencias en el mRNA naciente Sin necesidad de ningun otro factor de terminacion GC - haripin Rho dependiente Rho es factor de terminacion bacteriano Se mueve por la cadena naciente hasta alcanzar a la Pol y aborta la extencion Desestabiliza el hibrido y detiene alargamiento Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Fig

34 Regulation of the lac operon in E. coli
Operon es un mRNA policistronico que se activa dependiento de la fuente de carbono disponible para Ecoli SI hay glucosa y no lactosa esta, inactivo porque la bact usa glucosa Si estan los dos, activo a bajo nivel, porque hay glucosa suficiente y hay materia primas para procesar Si hay lactosa y no glucosa, activo a altos niveles, hace falta una fuente de C secundaria; lactosa 3 proteinas para el metaboismo de lactosa Actividad del operon regulada por la union de factores represores o activadores Represor esta activo y pegado si no hay lactosa Inactivo y libre si hay lactosa, la transcripcion se activa Cap esta inactivo si hay glucosa Cuando baja glucosa llega cAMP y lo activa Este se pega al DNA y atrae a la polimerasa Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

35 -5 genes para 5 proteinas en un mRNA (policistrónico)
08_06_single.promot.jpg Operon de Triptofano Ejemplo clásico de control y regulación de expresión en base a la necesidad de alimentos (cambios en ambiente) 08_06_single.promot.jpg – Operon de triptofano Los switches de transcripcion permiten a la celula responder a cambios en el ambiente Los mejores ejemplos y mas conocidos son en bacterias y fagos Bact regulan su expresion en base a las fuentes de alimentacion en el ambiente (glucosam fuentes de Carbono) Operon de triptofano – 5 genes para 5 proteinas en un mRNA policistronico todos transcritos a la vez Si no hay triptofano. Se expresan para fabricarlo Si aparece triptofano y entra a la celula; operon se apaga PLT no se expresan los genes Como opera -5 genes para 5 proteinas en un mRNA (policistrónico) -transcripción y traducción simultánea -No triptófano – operón se enciende -Si triptófano – operón se apaga

36 Operon de Triptófano - Como opera?
08_07_repress.protein.jpg Operon de Triptófano - Como opera? Operador: Represor alostérico Triptófano? 08_07_repress.protein.jpg Operador es secuencia en el promotor q si esta libre permite a la pol transcribir Si se pega el regulador de transcripcion a el la pol no se puede pegar al promotor y se apaga Pero q tiene q haber para qel el regulador se pegue y reprima la transcripcion? Varias moleculas de TRIPTOFANO!!! El represor de triptofano es una molecula alosterica Se pega TRP cambia conformacion y se pega… al promotor si no hay triptofano la forma q adopta no lo deja pegarse al operador en el promotor El represor esta siempre presente… se expresa constitutivo a bajo nivel pero inactivo

37 Represores vs Activadores
08_08_activator.prot.jpg Represores vs Activadores 08_08_activator.prot.jpg Represores apagan genes y Activadores los prenden Represor de TRP es una proteina represora cuando esta activo, apaga genes, los reprime Activadores, proteinas activadoras cuando estan aactivas prenden genes Se pegan a la pol y la ayudan a pegarse al promotor … Dependen de q otra molecula los active EJ CAP es un activador dependente de [cAMP] para poderse pegar al DNA Estos genes regulados por CAP son expresados si [cAMP] intracelular aumenta Esto pasa cuando ya no hay glucosa y entonces CAP prende otros genes para metabolizar otras azucares Represor activo: reprime genes - Se pega al promotor Activador activo: activa genes Se pegan a la pol y la estimulan Ambas son alostéricas Ej: CAP – activador - Dependiente de cAMP [cAMP ] aumenta cuando no hay glucosa, para que se metabolicen otra azucares

38 Operón de Lactosa Un activador y un represor controlan el operon de Lactosa Un promotor controlado por dos reguladores de transcripción: Lac operon controlado por; lac represor y CAP activador - Codifica proteinas para importar y metabolizar lactosa En ausencia de glucosa: cAMP aumenta y se ativan los genes regulados por CAP CAP prende los genes para lactosa , pero si esta lactosa presente; sino para q los necesita seria perder esfuerzo - Lac represor los apaga cuando no hay lactosa El operon es expresado cuando se dan dos condiciones: Lactosa presente y glucosa ausente Si no estan LAS DOS, no opera

39 08_09_lac operon.jpg 08_09_lac operon.jpg – Un activador y un represor controlan el operon de Lactosa Un promotor controlado por dos reguladores de transcripcion: Lac operon controlado por lac represor yCAP activador Codifica proteinas para importar digerir lactosa En ausencia de glucosa: cAMP aumenta y se ativan los genes regulados por cap (cAMP) rojo CAP prende los genes para lactosa , pero si esta lactosa presente; sino para q los necesita seria perder esfuerzo Lac represor los apaga cuando no hay lactosa El operon es expresado cuando se dan dos condiciones: Lactosa presente y glucosa ausente

40 Regulación de Expresión: Factores de Transcripción
Sistema de regulación de genes Procariotas Señales del ambiente Temperatura Concentración de nutrientes Eucariotas Regulación genética Factores de transcripción 6% genoma humano

41 Regulación de Expresión: Elementos de regulación
Promotores proximales Proteínas reguladoras TATA box RNA Pol II CCAAT box Herpes Virus GGGCGG “house keeping genes” Elementos son secuncias que su presencia afecta la expresion de alguna forma Como se detectan y se estudian estos? NEXT SLIDE

42 Assay for RNA polymerase II promoter regulatory elements
Se muta Se clona Se transforma Se mide expresión Ejemplos CCAAT – Timidine Kinase, Herpes GCGCG –SP1, Houskeeping Para descubrir y caracterizar elementos reguladores Mutacions en clustres upstream para detectar promotores proximales Quimera – Gen reportero y region upstream (promotora) Se muta, se liga, se transforma y se mide la expresion Promotores proximales son regiones de 10 pb upstream del TATA CCAAT es uno de ellos de herpes para timidina quinasa gene GGCGCC – para SP1 para houskeping genes Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

43 RNA polymerase II promoter regulatory elements Combinatorial Control
Regio upstream de gen para metalotioneina Contiene binding sites para varios TF Glucocorticoid recptor Metal resopnse elements Etc Control combinatorial – variando concentraciones de distintos factores para regular la transcripcion Transcription factor binding sites Fig Región Upstream 5’ para metalotioneina Varios TF binding sites Glucocorticoid Receptor Metal Reponse Elements Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

44 Regulacion de Expresión : Enhancers Que son?
Responden a estrés (estímulos) celular Aumenta la razón (velocidad) de iniciación del promotor. Funcionan independientes de localización y distancia) Al principio 5’ En el medio Al final 3’ Funcionan en cualquier orientación con relación al promotor No se encuentran asociados a todos los genes. Son células (tejido) específicos Responsable de un efecto sinergístico Modulares Clusters de elementos reguladores en el DNA cis, en otras palabras de binding sites Similares a elementos proximales de promotores Son celulas especificos Pueden ser transplantados

45 Regulación en Eucariotas
- Reguladores de transcripcion controlan la expresion a la distancia - Usan activadores y represores pero estos se unen a regiones conocidas como enhancers… aumentaban la expresion dramaticametne - Lo hacen a miles de bp y tanto upstream como dowstream COMO - El modelo sugiere un loop del DNA trayendo cerca del promotor y del complejo de iniciacion la region donde esta el regulador - Activadores y mediadores facilitan el ensamblaje del complejo de iniciacion o lo sabotean - Tambien atraen proteinas que modulan estructura de la cromatina afectando la accesibilidad de promotor a los factores y la poimerasa

46 Enhancer elements provide a further level of gene regulation
Clusters de factor binding sites influencia en la expresion no importa donde ni cuan lejos Indepenciente de orientacion Enhanseosoma – complejo de secuencia y proteinas q lo reconocen Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

47 08_13_gene.activation.jpg 08_13_gene.activation.jpg En Eucariotes
Reguladores de transcripcion controlan la expresion a la distancia Usan activadores y represores pero estos se unen a regiones conocidas como enhancers… aumentaban la expresion dramaticametne LO hacen a miles de bp y tanto upstream como dowstream COMO El modelo sugiere un loop del DNA trayendo cerca del promotor y del complejo de iniciacion la region donde sta el regulador Activdores y mediadores facilitan el ensamblaje del complejo de iniciacion o lo sabotean Tambien atraen proteinas que modulan estructura de la cromatina afectando la accesibilidad de promotor a los factores y la poimerasa

48 Assays for proteins that bind specific DNA sequences
- Prot. nucleares + Prot. nucleares Evidencias de que proteinas interactuan con DNA Footprinting – EMSA DNA marcado se divide en dos reacciones Uno sin el factor el otro con el factor Digestion enzimatica controlada q va cortando base por base Electroforesis de alta resolucion Las bandas q se pierden en la reaccion con el factor no estan Porq el factor pegado alli las protegio de la enzima – secuenciar! EMSA – DNA putativo marcado radioactivamente Incubar con extracto de proteinas o mezclas o con la proteina como tal Compara mobilidad de sonda de DNA donde se pega la proteina Vs la mobilidad de la sonda + proteina q debe ser mas gde y migrar menos Super shift con un + AB Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

49 - Extraccion cromatina + proteinas - Crosslink con formaldehido
Chromatin immuno-precipitation (ChIP) assay for protein binding sites on DNA - Extraccion cromatina + proteinas - Crosslink con formaldehido - Digestion al azar - Inmunoprecipitacion - Disociacion de DNA/proteínas PCR + microarray para las secuencias Identifica genes o secuencias presentes junto a nucleosoma Extraes cromatina manteniendo las intreacciones prot DNA y con formaldehido las haces permanentes Digieres al azar con nucleasa en fragmentos de cientos de bp Inmuno precipitacion Separar las proteinas Etudiar las secuencias que se protegieron por PCR o por microarray Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

50 Transcription factors consist of modules
Como son las TFs? Modulares Dominios separables Caracterización por combinación El dominio activador de 2 podra activar a 1? Como se haria el experimento? Como son los F T – Modulares por sub u o dominos que pueden ser intercambiables A – ilustra dominios por separadas – caracterizacion de dominios B ilustra funcion de dos TF separados Ilustra como combinando dominios puedo hacer q el dominio de uno controle otro quimericos Metodo cientifico Observaciones, son modulares Curiosidad seran intercambiables? Pregunta especifica: el dominio de 1activador podra sustituir al de 2? Diseno experimental: aislar, cortar, clonar, transformar, medir Resultado: Si hay expresion del gen 2 usando una quimera de DNA binding 1 con Activador 2 Conclusion : Son intercambiables, conservados, Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

51 Transcription factors recruit enzymes that modify chromatin
Como activan? Complejo de remodelación de la cromatina Acetilación Metilación Fosforilación Que hacen? Reclutan enzimas modifcantes Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Fig

52 Promotores en nucleosomas, como los liberamos?
08_14_chromatin.struc.jpg Promotores en nucleosomas, como los liberamos? 08_14_chromatin.struc.jpg El empaquetamiento de DNA del promotor en los nucleosomas puede afectar la iniciacion de la transcripcion -Hay q tomar en cuenta el empaquetamiento en esto de la expreion genetica Si un nucleosoma esta sobre un promotor va a inhibir la iniciacion de transcripcion Eso es para evitar liqueos de transcripcion pero hay q tener como modificarlo Las activadores recrutan proteinas q modifican la estructura Acetilaciones de a lisinas Deacetilaciones Remodelacion de la cromatina -acetilaciones de lisinas -deacetilaciones -remodelacion

53 Control Combinatorial en Eucariotes
Permite la integración de multiples señales reguladoras en genes individuales Procariotes – operon lac es controlado por lactosa y glucosa Glucosa ausente, lactosa presente Eucariotas Elementos que se unen al DNA en diferentes regiones Sinergismo Enhancers Interacciones entre factores Interacciones entre factores y cromatina Complejos de remodelación de la cromatina Glucosa + / lac ausente – no funciona Glucosa + / lac + : funciona parcial Glucosa - / lac – funciona full Glucosa

54 Regulation of transcription factor activity
COMO se regulan Regulacion de acttividad e factores d etanscrp Sintesis De novo del factor de transcripcion, incluye regular transcripcion y traduccion del factor mismo Con el ligando – se activa, se sintetiza inactivo hasta q se pega al ligando Fosforilandolo – postraduccional control Dimerizandolos – homo o hetero dimeros Localizandolo – bloqueando su transporte Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

55 Principal punto de control Es el principal intermediario Genes on/off
08_04_gene.reg.prot.jpg Transcripciónal: Principal punto de control Es el principal intermediario Genes on/off Proteinas que se pegan a secuencias reguladoras otras q no son el promotor Zurco mayor 08_04_gene.reg.prot.jpg El principal punto de control es el 1- Transcripcion si no hay RNA no habran intermediarios Como funcionan los interruptores geneticos – 50 anios atras no se podia pensar q fuera posible prender o apagar gener o q ells funcionaran de esa forma Avances en Ecoli reguladores de transcripcion, proteinas q controlan expresion a nivel de transcripcion punto 1 Proteinas q se pegan a secuencias reguladoreas del DNA – ademas del promotor Cortas en bacterias y largas en eucariotes Trabajan no por si solas sino por proteinas q las reconocen reguladores de transcripcion Ambas cosas forman el switch Las proteinas se unen al zurco mayor, interaccionan cn las bases y separan la doble helice

56 Factores de Transcripción
Clasificación Modo de interacción, arreglo molecular Helix –turn-helix Homeodominios Zinc fingers Helix-loop-helix Leucine zippers Asignado tabla 15 – 2 Enfermedades por factores de transcripcion P 270 Como se descubren o caracterizan?

57 Homeodominios 08_05_binding motifs.jpg Zinc fingers Leucine Zipper
08_05_binding motifs.jpg Distintos binding motifs Homeodominio – A Y B - 3 helices alfa la q mas contacto hace es las roja (3) Asparagina con Adenina Homeodominios – 69 aa, descubierto en Drosophila, conservado, reconoce por Helix turn helix - dos helices una se siente en el zurco mayor reconoce secuencia de 6 bp Zinc finger (C) una helice alfa y una placa B unidos por una molecla de zinc Se encuentran en pares unidos al Zurco mayor y la helice alfa toca las bases Zinc fingers – identificada en TFIIIA de RNA pol III y luego en la II - cada dedo tiene 30 aa con par de cisteinas e histidinas conservadas q se unen a un Zinc Steroides como el GCS son zinc fingers pero - son 4 residuos de cisteina - el dedo e sde dos helices - incluyen un dominio para dimerizacion, dosmoleculas funciona como una D) Zipper de Leucina formado por dos helices alfa cada una viene de una proteina disinta Se une al DNA como dimeros, como un pinche de ropa Leucine Zipper

58 DNA recognition structures of some transcription factors
Ejemplos Tabla 15-2 asignada con sus enfermedades Homeodominios – 69 aa, descubierto en Drosophila, conservado, reconoce por Helix turn helix - dos helices una se siente en el zurco mayor reconoce secuencia de 6 bp Zinc fingers – identificada en TFIIIA de RNA pol III y luego en la II - cada dedo tiene 30 aa con par de cisteinas e histidinas conservadas q se unen a un Zinc Steroides como el GCS son zinc fingers pero - son 4 residuos de cisteina - el dedo e sde dos helices - incluyen un dominio para dimerizacion, dosmoleculas funciona como una Leucine zipper (basics) dos motifs o dominios - uno basico q reconoce el DNA - otro con una serie de leucinas repetidas responsables de la dimerizacion - forman una helice alfa que se dimeriza como coiled coil por contacto entre aa hirofobicos - Fig Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

59 Homeodominios NNTAATGGNN Descubierto en Drosophila 60 aa
Regula el desarrollo Presente en muchos factoes de transcripcion eucariotas Reconocen via un HTH Homeodominios – 69 aa, descubierto en Drosophila, conservado, reconoce por Helix turn helix - dos helices una se siente en el zurco mayor reconoce secuencia de 6 bp NNTAATGGNN

60 Helix turn Helix HTH motif
Tiene dos helices alfa una va al zurco mayor No es un un dominio solo, siempre esta como parte de homeodominios

61 Zinc Fingers y Leucine Zipper
ID en TFIIIA Y en Pol II factors 30 aa con cisteinas e histidinas conservadas que ligan zinc Dedos en los zurcos dle dna Receptores esteroides , cisteinas para zinc y dos helices por dedo en vez de una Dimerizan para actuar Leucina – Dominios con dos regiones: una basica q se une al dna Hotra de leucinas repetidas zipper que media dimerizacion El q se pega a CCAAT

62 University of Puerto Rico Intercampus Doctoral Program in Biology
E2- Mechanism of Action Receptores de Esteroides son factores de transcripcion From Geneka Biotechnology