Electromedicina e Instrumentación Biomédica

Presentación del tema: "Electromedicina e Instrumentación Biomédica"— Transcripción de la presentación:

1 Electromedicina e Instrumentación Biomédica
Unidad 9. Laboratorio clínico

2 Importancia del laboratorio clínico
La importancia del Laboratorio Clínico en el hospital puede comprenderse fácilmente si se considera que en él se hacen miles de medidas cada día, y que sus resultados tienen gran repercusión en el diagnóstico o en la evaluación de la eficacia de una terapia. Por su función y la instrumentación empleada se pueden distinguir tres secciones: Bioquímica, Hematología y Microbiología o Biopatología.

3 Función del laboratorio de Bioquímica
Análisis químico de líquidos: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, etc.; para detectar la presencia de determinadas moléculas o sustancias, para medir la concentración de ciertos componentes, bien sean iones: H+, Na+, K+, Cl-; gases disueltos en la sangre: O2, CO2, CO; metabolitos: glucosa, urea, lípidos; moléculas complejas de origen biológico: proteínas, colesterol, etc.; o sustancias tóxicas: alcohol, barbitúricos. Normalmente, la sustancia de interés está presente sólo en cantidades minúsculas, y no tiene ninguna propiedad que permita diferenciarla directamente del resto. El análisis requiere, pues, la realización de una o varias de las siguientes funciones: Separar la sustancia de otras que pueden interferir en la medida (por ejemplo, porque se va a medir mediante una técnica no específica). Hacerla reaccionar de forma que se pueda poner de manifiesto su presencia. Medir esta manifestación.

4 Función del laboratorio de Hematología
Determinación del número y características diferenciales: forma, tamaño, etc., de las células sanguíneas. Estudio de la coagulación y la fibrinólisis (hemostasis). Determinación de los antígenos y anticuerpos de los grupos sanguíneos. Esta función, propia de los bancos de sangre, puede estar integrada en una sección específica aparte. Sólo para la primera de estas funciones se ha introducido una cantidad de instrumentos electrónicos importantes orientados hacia la automatización.

5 Función del laboratorio de Microbiología o Biopatología
Detectar la presencia o ausencia, en una muestra, de microorganismos (patológicos o no). Los métodos empleados son a veces empíricos. Se basan en las relaciones existentes entre el metabolismo de los microorganismos en un medio de cultivo y las modificaciones que producen en éste. En la actualidad, se tiende a introducir métodos más directos que contemplan al microorganismo como un ente químico a identificar, del mismo modo que se haría para una molécula orgánica compleja. Desde el punto de vista de la instrumentación, las técnicas empleadas difieren poco de las habituales en bioquímica o hematología.

6 La sangre La sangre está formada por un líquido de composición complicada y variable, el plasma que contiene eritrocitos, leucocitos y plaquetas en suspensión. Impidiendo la coagulación, los elementos pueden ser separados del plasma que tiene un color paja pálido. Cuando la sangre se coagula, el líquido que queda después de separarse el coágulo, se denomina suero. La diferencia fundamental entre el plasma y el suero consiste en que este pierde el fibrinógeno proteico, que se convierte en filamentos insolubles de fibrina en el curso de la coagulación. La sangre para pruebas de laboratorio puede ser capilar o venosa. La función principal de la sangre es transportar compuestos y sustancias químicas así como 02, C02, nutrientes, metabolitos, vitaminas, y electrólitos.

7 Composición de la sangre
Glóbulos Rojos, Eritrocitos o Hematíes. (Red Blood Cell - RBC): Transportan oxigeno a los pulmones y los tejidos entre otras funciones. Glóbulos Blancos (WBC, Leucocitos): Responsables de la defensa inmune de nuestro cuerpo contra las bacterias, virus, las partículas extrañas e incluso los materiales de desechos propios del cuerpo como ruinas de RBC. Leucocitos

8 Composición (2) Plasma: Es lo que queda de las células sanguíneas que son incoagulables después de centrifugadas. Está compuesto por agua, proteínas de alto peso molecular (Albúmina 55%, Globulina 42%, Fibrinógeno 3%), y las moléculas descargadas de bajo peso molecular (Glucosa, Urea, etc.) e iones (Na +, K+, Cl-, Ca++, Mg++, HCO3-) que están disueltos. Plaquetas (Trombocitos): Cuando cualquier parte de nuestro cuerpo se daña, nuestro sistema de reparación es activado para contrarrestar el daño. Las plaquetas y fibrinógenos son responsables de sellar los vasos sanguíneos dañados en unos pocos minutos es decir mantienen la integridad vascular. Normalmente tiene un diámetro de 2 a 4 m, por lo que son los elementos más pequeños de la sangre. Los valores normales son de a plaquetas/l. Son muy difíciles de contar debido a que son pequeñas. Suero: Básicamente igual que el plasma salvo que el Fibrinógeno está ausente, en el suero no hay casi factores de coagulación

9 Glóbulos Rojos 1 litro de sangre contiene aproximadamente 41% RBC en mujeres y 46% en varones. Este porcentaje también se expresa por el hematocrito (Hct). Un adulto que tiene 46% de RBC en 1 litro de sangre tiene un Hct de 46. El tamaño de un RBC es aproximadamente 7.5 m de diámetro y 2 m de altura. Sus dimensiones son tales que ellos pueden atravesar los pequeños capilares sanguíneos para los procesos del intercambio con los tejidos circundantes. Eritrocitos

10 Glóbulos Rojos (2) La función principal del RBC, llevar O2 y CO2 a los pulmones y tejidos, se realiza a través de hemoglobina, HB (en los adultos masculinos la hemoglobina está alrededor de 160 g/l sangre, y en las mujeres 145 g/l) y la enzima el anhídrido carbónico. Se forma en la médula ósea. hierro, cobalaminas, y el ácido fólico son algunos de los requisitos. En el feto, se producen eritrocitos en el bazo y el hígado. Los RBC inmaduros en la médula son nucleados pero pierden sus núcleos cuando alcanzan el torrente sanguíneo. La producción de RBC es controlada principalmente por un mecanismo hormonal. La deficiencia celular de O2 es la inicializadora en la producción y descarga de eritropoyetínas, hormona que estimula la producción de la célula roja en la médula ósea. Más de 90% de eritropoyetína se produce en el glomérulo del riñón; el resto, se produce principalmente en el hígado. El tiempo de vida de los RBC es de aproximadamente unos 120 días. Los RBC viejos son transportados por la sangre y se degradan. Cuando la membrana de RBC rompe (hemólisis), HB es liberada y se metaboliza por la globina y bilirrubina. El hierro de la HB se recicla.

11 Hemoglobina Componente principal de los glóbulos rojos, es una proteína conjugada que sirve de vehículo para el transporte de oxígeno y de CO2. Totalmente saturada contiene alrededor de 1,34 ml de oxígeno por gramo. Su función principal es el transporte de oxígeno de los pulmones, donde la tensión del oxígeno es elevada, hacia los tejidos, en donde es baja. Consiste en cuatro subunidades, cada una contiene un grupo Heme. El Heme es un complejo de pofirina y Hierro (Fe2-). Cada uno de los cuatro Fe2-, se combina reversiblemente con una molécula de O2. El proceso se llama oxigenación, y respectivamente desoxigenación. Cuando totalmente se saturó con oxígeno (O2), 1 mol HB liga 4 mol O2 ó 1 g de HB puede llevar 1.39 l O2.

12 Hemoglobina (2) La saturación completa ocurre a una PO2 de valor igual a 150 mmHg. Los glóbulos rojos, están creciendo entre de 5 y 10 días en la médula ósea y tienen un tiempo medio de vida de aproximadamente 4 meses. Menos del 2% del Oxígeno transportado se disuelve en el plasma y refleja en la PO2 medida. Más de 98% se una reversiblemente a la hemoglobina. La concentración de hemoglobina total (tHB) no sólo varía con el sexo, la edad, la altitud sino que también con el origen racial si se es europeo, indio, africano, etc. La concentración media de tHB en sangre es 15 g/dl para un adulto el varón europeo; considerando que el valor de una hembra india raramente sería tan alto como 11 g/dl. La Hemoglobina Total consiste en varias docenas de derivados diferentes de la hemoglobina. Conociendo el volumen de varios derivados en la sangre de un paciente permite el diagnóstico de una variedad de anormalidades. Pueden determinarse la función del corazón, pulmones y el sistema circulatorio.

13 Hemoglobinometría Es la medida de la concentración de hemoglobina en la sangre. Los métodos empleados pueden agruparse en cuatro clases diferentes, según su técnica básica y sus variantes respectivas: métodos colorimétricos, gasométricos, densimétricos y químicos. En el método colorímetrico, la hemoglobina se mide como oxihemoglobina o se convierte primero en uno o varios compuestos como puede ser entre otros la cianometahemoglobina, también está la hematina ácida, la hematina alcalina etc. El más utilizado es el método de la cianometahemoglobina. La banda de absorción está en la región de 540 Nm.

14 Relación entre el Hematocrito y la Hemoglobina
El Hematocrito (Hct) es el volumen de eritrocitos expresados como un porcentaje del volumen de sangre total existente en una muestra. Un valor de Hct de 0.45 (45%) significa que un litro de sangre total contiene 0.45 litros de glóbulos rojos y 0.55 litros de plasma (el componente líquido de la sangre), puede decirse que el Hct es la concentración de eritrocitos en un litro de sangre total. La concentración de Hemoglobina (HB) en la sangre total se expresa en gramos/l (g/l), o mmol/l. La MCHC es la concentración media de hemoglobina por 100 ml de hematíes concentrados, en %. Es así posible calcular la concentración de Hemoglobina en sangre total cuando MCHC y Hct son conocidos. Si MCHC es constante como normal, entonces los tHB pueden ser calculadas usando el valor del Hct solamente y viceversa: MCHC = HB/Hct = constante (caso normal)

15 Clasificación de equipos según principio de funcionamiento
Para estudiar los instrumentos en el laboratorio clínico es conveniente separarlos según su principio de funcionamiento: Electrotérmicos: Calientan agua o aire. Electromecánicos: Realizan movimientos mecánicos y giros a partir de un motor. Electro-ópticos: Se basan en la absorción y transmisión de la luz por parte de la muestra. Electroquímicos: Intervienen reacciones químicas para la medición, utilizando generalmente electrodos. Analizadores Automáticos: Realizan funciones complejas, utilizando técnicas combinadas.

16 Detectores El análisis de los fluidos biológicos en el laboratorio clínico se basan en la detección de propiedades fisicoquímicas las cuales son de interés analizar. El modo primario de detección en muchos instrumentos de laboratorio es la detección de la energía luminosa (fotodetección). Los detectores de temperatura, composición del gas y radiación, son usados comúnmente. Cada modo de análisis requiere un tipo de detector específico. Algunos detectores difieren en su diseño, construcción y principio operacional. Una característica que todos tienen en común es la habilidad de detectar una forma de energía y convertirla en otra forma. Tales dispositivos electrónicos son llamados transductores.

17 Transductores Los transductores usados en los instrumentos del laboratorio clínico, usualmente detectan propiedades físicas o químicas (ejemplo luz, calor, moléculas de gas y radiaciones) las cuales usualmente se convierten en energía eléctrica. Una excepción de esto lo tenemos en el transductor de detección de radiación, primero la energía radiante se transforma en luz o radiación electromagnética por un tipo de transductor (ejemplo el contador de centelleo de flúor, el flúor es una sustancia que emite luz cuando es expuesta a una radiación) y después es convertida en energía eléctrica por otro transductor (ejemplo el fotodetector). La señal eléctrica producida por el transductor usualmente es procesada (la señal se amplifica antes de llegar directamente el dispositivo de lectura).

18 Detectores fotosensibles
Espectrofotómetros, fluorímetros, fotómetros de llama, espectrofotómetros de absorción atómica y contadores ópticos de células, son ejemplos de instrumentos que usan fotodetectores. Los fotodetectores mas comunes son la celda de capa de barrera (Cell Barrier Layer), fototubos, tubo fotomultiplicador y variados fotodetectores a semiconductores tales como fotorresistencias, fotodiodos y fototransistores. Todos estos dispositivos son fotosensibles o son materiales fotoemisivos que liberan electrones cuando son expuestos a energía luminosa. Cuando se cierra el circuito los electrones libres producen corriente por el mismo.

19 Celda Fotovoltaica Genera electricidad a su salida directamente a través de la energía de la luz, no requiere de una fuente externa. Para su construcción usualmente se usa un material semiconductor el selenio. Se deposita una capa fina de selenio una capa de metal, usualmente hierro. El selenio se recubre con una capa transparente de laca (plata). Se protege con un vidrio sobre la superficie laqueada y la celda es encapsulada en plástico. El hierro actúa como el electrodo positivo y el selenio como el electrodo negativo. Cuando la luz incide hace que el selenio libere algunos electrones. Los electrones emitidos son recogidos por la plata laqueada. Cuando la celda está conectada en el circuito, los electrones fluyen del colector (electrodo negativo) a través del circuito hasta el electrodo de hierro y finalmente regresa al selenio. La corriente producida es directamente proporcional a la intensidad de la energía luminosa que incide sobre la superficie fotosensible.

20 Celdas fotovoltaicas (2)
La respuesta espectral de la celda de selenio es de 380 a 700 Nm. La respuesta óptima ocurre entre 500 y 600 Nm. (colores verde y amarillo). Esta celda se usa en algunos Fotocolorímetros o Espectrofotómetros que miden con relativamente altos niveles de iluminación. Instrumentos sofisticados de laboratorio como Espectofotómetros con una estrecha banda, no puede usar una celda de capa de barrido como fotodetector debido al bajo nivel de energía luminosa dirigida al detector. Entre los problemas que presentan tenemos bajo nivel de energía luminosa directa al detector, fenómeno de fatiga, el cual se refiere al decrecimiento gradual en la tensión de salida de la fotocelda debido a la continua exposición a la energía luminosa. Altos niveles de iluminación acentúan este efecto de fatiga, la salida de tensión de la celda es sensible a los cambios de temperatura .

21 Fototubos Consiste de una lámina de material fotosensible curveado que sirve como cátodo (emisor) y por tanto cargado positivamente, sirviendo el tubo como ánodo (colector) El cátodo del fototubo se recubre con un material fotosensible ejemplo el celcio-antimonio y multialcali (Sb/K/Na/Cs) los cuales emiten electrones cuando son iluminados. El número de electrones emitidos es directamente proporcional a la intensidad luminosa sobre el cátodo. El ánodo recoge los electrones producidos por el cátodo, ambos cátodo y ánodo son sellados al vacío en una envoltura de vidrio. Ambos electrodos reciben un potencial DC (corriente directa: corriente que fluye en una sola dirección, donde la corriente nunca cambia la polaridad ni la magnitud en el período de tiempo) que es provisto por la fuente de energía del instrumento.

22 Tubo Fotomultiplicador (PMT)
El tubo fotomultiplicador consiste de un cátodo y un ánodo con varios electrodos fotosensibles (entre 8 y 16) llamados dinodos (es el responsable de amplificar la señal eléctrica), los cuales son encapsulados en vidrio al vacío. Cuando la energía luminosa incide sobre el cátodo los electrones emitidos son atraídos por el primer dinodo. En el dinodo cuando choca cada electrón primario causa la emisión de tres a seis electrones secundarios. Los electrones emitidos desde el primer dinodo son enfocados y atraídos por el segundo dinodo, donde el proceso es repetido. La reacción en cadena continúa a través de la serie entera de dinodos hasta que alcanzan el ánodo. El resultado es una amplificación de la señal inicial. El número de dinodos máximos en un fotomultiplicador es 16. Igual que en el fototubo convencional, el número de electrones emitidos por unidad de tiempo es directamente proporcional a la intensidad de la luz incidente sobre la superficie fotoemisiva. El PMT es 200 veces más sensible que el sistema de fototubo convencional. También el fotomultiplicador puede responder a interrupciones de 109 segundos.

23 Detectores con semiconductores
Primariamente un semiconductor es usado en un circuito para regular el flujo de corriente cambiando su resistencia interna. Esto es llevado a cabo por cambios en el potencial de polarización a través de la unión P-N. La resistencia interna de un transistor es también controlada de similar manera. Diferente al semiconductor convencional el cual responde directamente a cambios en la tensión, los fotodetectores con semiconductores tales como fotorresistencias, fotodiodos y fototransistores que responden a cambios en la polarización como resultado de la absorción de la energía luminosa. Los semiconductores fotodetectores tienden virtualmente a remplazar a los fototubos convencionales y en muchos casos a los tubos fotomultiplicadores en los modernos instrumentos de laboratorios.

24 Fotoresistencia El fotodetector más simple es la fotoresistencia o fotoresistor. Es una celda al vacío que contiene dos conductores adheridos a una fina capa de material fotoconductivo depositados en un material transparente como cuarzo o vidrio. Este dispositivo es conectado en un circuito de forma tal que recibe potencial constante. Cuando los fotones inciden sobre el material fotoconductivo expuesto, ocurre un aumento o disminución de la resistencia. Con un cambio en la resistencia hay cambio en la corriente que corresponde a la intensidad de la luz que incide. El material fotoconductivo del fotoresistor responde a energía luminosa infrarroja, ultravioleta y visible.

25 Fotodiodos Un diodo de unión convencional P-N es convertido en un fotodiodo adicionándole una lente de colimación (lente convergente que o transmite o refleja la luz, reúne los rayos de luz y los enfoca organizándolo en un rayo de luz paralelo) que enfoca la luz incidente en la unión. El fotodiodo es colocado en orientación a que se polarice inversamente en el circuito detector. Cuando la luz incide en el fotodiodo los electrones son liberados de la unión covalente del material semiconductor componiendo su propia unión. Los electrones liberados producen corriente que fluye a través del circuito. A medida que la energía luminosa de la luz incidente aumenta la corriente disminuye y viceversa.

26 Fototransistor El fototransistor (FT) y el fototransistor de efecto de campo (FFET) usa lente de colimación para enfocar la luz incidente sobre el material fotosensible en el área llamada base o compuerta (gate). La función propia de estos puede ser usada apropiadamente en los circuitos de polarización. Cuando la energía luminosa incide en el material fotosensible en la base o la compuerta, los electrones son excitados y se mueven del colector al emisor en el FT y del drenaje a la fuente en el FFET, llamada área de conducción. El resultado es una corriente que es proporcional a la energía luminosa incidente. A diferencia de los fotodiodos, los fototransistores también pueden amplificar señal. Típicamente la señal es aumentada de 50 a 500 veces más que en la mayoría de los fotodiodos.

27 Equipos electro-ópticos
Los dispositivos fotosensibles son sujetos a las mismas clases de limitaciones que el ojo humano, y pueden tener un rango óptimo en el cual son más sensibles. En un fotómetro la lectura de tramitancia puede ser reseteada cada vez que la longitud de onda cambie, el 100 % de tramitancia (T). Esto es debido a diferencias en la sensibilidad de la fotocelda a diferentes longitudes de onda. Para compensar esta diferencia en la sensibilidad, espectrofotómetros de exploración pueden tener slit variables accionados por una leva u otro dispositivo para que regule la luz total descendente en el fototubo.

28 Prismas y Redes de Difracción
Los dispositivos que son capaces de dispersar luz blanca para formar un espectro son llamados monocromadores (dispersa luz blanca en forma de colores). Hay dos tipos comúnmente usados en espectrofotometría, los prismas y la red de difracción: El prisma es una pieza de vidrio de cuarzo cortada de tal forma que tiene interfases en ángulos muy precisos. Esto puede producir un espectro de buena calidad encontrados en los mejores instrumentos. La red de difracción es una superficie altamente pulida dentro de la cual un número grande de estrías paralelas puede ser cortadas. Tal superficie es capaz de dispersar la luz y producir un espectro. La red puede reflejar o transmitir la luz. Los instrumentos fotométricos usados en el laboratorio clínico miden luz de varias formas.

29 Fotómetro Instrumento óptico que se emplea para medir la absorción de la luz. Según la ley de Lambert Beer, la absorción de la luz guarda relación con la concentración del soluto. En el laboratorio clínico el colorímetro es la versión más simple del fotómetro y por tanto también es un instrumento que mide absorción de la luz coloreada de una solución, en la cual la luz coloreada es producida por un filtro simple de vidrio.

30 Espectrofotómetro Instrumento que mide la absorción de la luz monocromática, la cual puede ser definida seleccionando una banda de un espectro producido por el monocromador, son más complejos que los anteriores y se diferencian además porque utilizan filtros, redes de difracción, prismas. El fotómetro de llama mide la emisión simple del elemento atómico calentado por una llama. El fotómetro de absorción atómica mide luz cuando absorbe cierta cantidad de átomos cuando son excitados por el calor.

31 Componentes del Espectrofotómetro
La fuente es necesaria para alimentar la lámpara de excitación. La lámpara de excitación, A, provee una luz que contiene colores en diferentes longitudes de ondas, luz policromática (representada por muchas flechas B) esta luz pasa a través de un filtro u otro dispositivo, C, esto permite luz de un color (D) incidiendo en la muestra, E, esta luz es llamada luz incidente. Parte de esta luz incidente es transmitida a través de la muestra y es llamada luz transmitida. La que queda de la energía luminosa es absorbida por las moléculas de la muestra, esta energía representa la energía de absorción consumida en el desplazamiento de los electrones de valencia en las moléculas de la muestra. Es obvio que más energía sería consumida si más moléculas estuvieran en el camino de la luz. Esto sería así , sí este aumento en las moléculas fuera debido a un camino más largo en la trayectoria de la luz a través de la solución o a una concentración más alta de moléculas en la solución. La luz transmitida representada por las líneas discontinuas F, choca con la superficie fotosensible de la célula, G, donde se produce una corriente eléctrica que es proporcional a la cantidad de luz. Esta llamada fotocorriente, H, fluye en el metro del circuito y causa el movimiento de la aguja en la escala del metro, I.

32 Absorción molecular Moléculas específicas o compuestos moleculares en una solución que absorben una energía de luz específica. La misma clase de molécula puede absorber la misma longitud de onda de la luz. La luz de una específica longitud de onda puede ser usada porque cada sustancia absorbe luz óptimamente en su longitud de onda específica. Para producir luz monocromática es necesario medir la absorción de la sustancia exactamente. Esto es necesario para identificar la intensidad de la luz como patrón (100 % T) y entonces medir cuanta luz es absorbida. Idealmente la luz incidente que cae sobre la muestra es luz monocromática pura, pero en la práctica puede contener algunas desviaciones de luz de varias longitudes de onda que de alguna forma han alcanzado la muestra. Usualmente la superficie interna de un monocromador es pintada de negro para lograr hacer las radiaciones de cuerpos negros ideales, o superficies que sean capaces de absorber todas las longitudes de onda de la luz, pero esto es un ideal que nunca se cumple completamente.

33 Ley de Beer - Lambert Describe la relación entre la intensidad de la luz que penetra y sale de una cubeta llena con una solución que absorbe luz de una determinada longitud de onda. La fracción de luz incidente absorbida es proporcional al numero de moléculas de soluto presentes en el trayecto luminoso, esto es: En donde: I0 = Intensidad de la luz incidente I = Intensidad de la luz Transmitida c = Concentración del soluto (mol / l) b = Longitud del trayecto (cm) k = Coeficiente de calibración. La constante k es una propiedad fundamental del soluto y depende de la temperatura, la longitud de onda y el solvente.

34 Absorbancia La tramitancia de una muestra designada como T, es el % de luz incidente que es transmitida a través de ella La absorbancia se define como el logaritmo de la relación I0 / I. En teoría la absorbancia puede variar entre cero (ninguna absorbancia) y el infinito (absorbancia completa). La mayor exactitud del fotómetro se alcanza en la gama de absorbancias comprendidas entre 0 y 1,0, pero en los buenos instrumentos puede llegar hasta 2,0. con un colorímetro se obtienen resultados fiables entre 0 y 0,7. Todas las cubetas a utilizar deben tener la misma absorbancia

35 Expresión rutinaria La ley de Lambert y Beer’s da origen a una serie de expresiones usadas rutinariamente en espectrofotometría. Sí las condiciones son mantenidas constantes tales como la absorción molar (a) y el camino de la luz permanece constante, entonces solamente permanece variable en la expresión la concentración y la absorbancia. Sí la absorbancia de un patrón y una desconocida que contiene la misma sustancia, son medidas, las dos pueden ser plasmadas por la siguiente expresión: Donde: Au = absorbancia desconocida Cu = concentración desconocida As = absorbancia patrón Cs = concentración patrón

36 Concentración vs absorbancia
La expresión representada por As / Cs es conocida como constante K, la cual representa la pendiente de la curva de calibración patrón. (Concentración vs absorbancia). Si Au es dividida por K el resultado es Cu.

37 Espectrofotometría de Absorción Molecular
La mayoría de las determinaciones hechas en el laboratorio clínico están basadas en la medición de la energía luminosa transmitida o absorbida bajo condiciones controladas. El dispositivo que es usado para detectar energía luminosa de la luz transmitida o absorbida es llamado fotómetro. Se emplean para la determinación de un gran número de sustancias de los líquidos orgánicos. Ellos difieren en lo que respecta a su fuente luminosa y al modo de producir luz monocromática. Existen los siguiente tipos: Instrumento con una fuente de luz que emite un espectro de rayas discretas (lámpara de cadmio o mercurio). Instrumento con una fuente que produce un espectro luminoso continuo (luz blanca) (lámpara de tungsteno y halógeno) que es descompuesto por una red de difracción o rejilla en sus diferentes componentes. Instrumento con una fuente que emite un espectro luminoso continuo (lámpara de tungsteno y halógeno), que se filtra para producir luz de la longitud de onda deseada. Instrumento con una lámpara diódica que emite luz monocromática.

38 Clasificaciones Los instrumentos pueden ser de haz único o simple beam o doble haz y/o doble beam: En un instrumento de haz único la luz pasa desde la fuente por un monocromador o filtro y después por una cubeta o celda donde se encuentra la muestra para llegar al detector. En un instrumento de haz doble, la luz pasa por un dispositivo de descomposición del haz y después separadamente por la cubeta o celda de muestra y la de referencia hasta dos detectores distintos. En el fotómetro de lámpara diódica no se necesita un filtro ni un prisma porque la luz emitida ya es monocromática. Debido a que estos instrumentos son ampliamente usados en el laboratorio clínico, es esencial un buen conocimiento de sus funciones. La necesidad de conocer bien este sistema, sus aplicaciones y el mantenimiento de sus partes son buenas herramientas para comprender mejor el equipo.

39 Componentes del Espectrofotómetro
Es necesaria la fuente de alimentación para el funcionamiento correcto de la lámpara de excitación Esta lámpara tiene que proporcionar un haz de luz intenso, constante y fresco para que pueda ser fácilmente colimado. El filamento debe ser pequeño y proveer una luz intensa y tiene que ser tal su diseño que pueda ser exactamente alineada cuando se cambie y debe ser altamente reproducible en todos sus aspectos. Cualquier objeto que cambie su temperatura, emite algunos espectros diferentes. Cuando hay variaciones del suministro, la lámpara no funciona correctamente. La lámpara toma un color amarillo si la tensión es baja y si la corriente tiene una sobre tensión por encima de su valor normal, la luz se pone más blanca. Sí los espectros producidos por la lámpara, en tal caso pueden ser comparados, sería inmediatamente obvio que en la misma área del espectro no dé la misma distribución de longitudes de onda. Por tanto la temperatura de la lámpara es importante. La calidad y uniformidad de construcción de la lámpara de excitación son factores significantes en el funcionamiento uniforme del instrumento espectrofotométrico.

40 Lentes de colimación Entre la lámpara de excitación y el monocromador se insertan frecuentemente lentes de colimación. Estas lentes colectan los rayos de luz y lo enfocan de forma tal que la luz pasa hacia el interior del monocromador siendo un rayo organizado de luz paralela

41 Monocromador Se utilizan para dispersar luz blanca en sus distintos componentes uno de los cuales se selecciona para la medición fotométrica. Una luz monocromática que parece ser color verde, tendría una longitud de onda de 550 nm, pero las longitudes de onda de 525 a 575 nm en longitud pueden estar presentes. El ancho de banda sería de 525 a 575 nm o 50 nm. Considerando que la luz verde pasa a través de un filtro de vidrio, toda la luz de longitud de onda igual a 550 nm pasa más o menos como luz azul verdosa. La luz azul puede pasar en pequeñas cantidades y un rastro del violeta (400nm) puede pasar también. En la misma forma amarilla verdosa, amarilla y naranja (600nm) se pueden presentar en cantidades decrecientes. Sí ploteamos la luz transmitida contra longitud de onda, entonces obtenemos una curva similar a la de la figura:

42 Filtros El monocromador más simple es un filtro de cristal, aunque este no puede aparecer porque el ancho de banda de un filtro es amplio y la luz que pasa incluirá más de un color. Un monocromador por causa del ancho de banda, el tamaño del filtro y la luz que pasa puede incluir más de un color. Los filtros de vidrio son hechos suspendiendo un agente colorante en el vidrio fundido. La densidad o espesor del filtro, la forma de moldeado de la mezcla y la cantidad de luz puede ser absorbida. Los filtros son identificados por: Peak de tramitancia Ancho de banda Espesor o capacidad. Un ancho de banda reducido puede ser obtenido por unir dos filtros de vidrio de colores diferentes. Solamente la longitud de onda que es pasada en común para ambos filtros constituirá el ancho de banda para este filtro compuesto. Los filtros de vidrio son usados solamente para la transmisión de luz visible y cercana al visible. Ambos filtros, que absorben en el IR y en el UV y transmiten luz visible, están disponibles y los filtros que transmiten cercano al UV y absorben luz visible también existen. Un buen filtro colorímetrico es suficientemente exacto y económico para hacer pruebas de rutina tales como concentración de hemoglobina.

43 Slit o rejilla Lo más ampliamente usado como monocromador es el slit, un prisma o rejilla de difracción para dispersar luz y un slit de salida para seleccionar el ancho de banda. El slit de entrada es generalmente fijado y diseñado para limitar la luz de colimación permitida que incide en el prisma y la rejilla. La luz reflejada es por tanto reducida aún mínimo. Cuando la luz incide en un prisma es dispersada y forma un espectro. Esto ocurre porque el ángulo de refracción y la interferencia (como la que hay entre el aire y el vidrio del prisma), varía con la longitud de onda. De este modo el violeta es refractado más que el rojo y el espectro es formado. El índice de refracción determina la propagación del espectro y el ancho de la banda de color relativo. El vidrio es el material de mejor opción para la luz visible, UV que son absorbidas por este. El cuarzo y la fusión de sílica son preferibles para la luz UV, pero cuando ellos son usados cerca del infrarrojo y en la región del infrarrojo, la banda de color producida es muy estrecha para el uso práctico. La razón para esto es evidente en la figura:

44 Difracción de la luz por medio de una red de difracción
El espectro es distorsionado y proyectado en un ángulo al dorso de la pared del monocromador. En el final del color rojo del espectro está la menor distorsión, y al final del azul del espectro hay una mayor distorsión. Los espectrofotómetros de alta calidad han usado prismas de cuarzo o vidrio en sus monocromadores. Con ellos se produce un espectro muy limpio y el mecanismo puede ser muy preciso. En estos momentos se fabrican redes de difracción de alta calidad muy económicas por lo que la mayoría de los espectrofotómetros de buena calidad incorporan la red de difracción. Cuando la luz blanca choca con la rejilla, esta es difractada en forma de varios espectros.

45 Porta muestra o porta cubeta
Una cubeta es el recipiente transparente utilizado para contener la solución de prueba. Pueden fabricarse con cristal de cuarzo, vidrio normal o plástico transparente. La mayoría son rectangulares y tiene un trayecto interno de 1 cm. Sobre el uso de las cubetas o celdas para las muestras se deben hacer algunas observaciones. Unas cubetas o celdas cuadradas que presentan una superficie plana a la luz incidente, tienen pérdidas más ligeras de reflexión que una cubeta o celda redonda. Esta pérdida es más notable en una cubeta vacía porque la diferencia en el índice de refracción entre aire y vidrio es mayor que entre vidrio y solvente. En la rutina de trabajo esta pérdida no es probablemente significante, siendo bastante constante a aproximadamente 4% para la mayoría de las cubetas redondas. Debe ser obvio que las cubetas deben estar completamente limpias y libre de las huellas digitales, rayado y nublando y que deben emparejarse con la cubeta de referencia. También debe estar claro que una trayectoria de la luz más larga a través de la muestra permitirá lecturas más exactas en muestras diluidas. Las cubetas pueden fabricarse con cristal de cuarzo, vidrio normal o plástico transparente. La mayoría de las cubetas son rectangulares con trayecto interno de 1 cm. Las cubetas fabricadas con cristal de cuarzo pueden utilizarse con fuentes luminosas que producen luz visible (longitud de onda de 400 a 800 nm) o ultravioleta (200 a 400 nm). Las cubetas de vidrio normal y plástico pueden utilizarse con luz de una longitud de onda comprendida entre 340nm (365 nm de preferencia) y 800 nm y son apropiadas en las mediciones corrientes. Las cubetas de plástico son habitualmente de peor calidad, pero son más baratas que las cubetas de vidrio y pueden eliminarse después de su uso. Las cubetas de vidrio son fáciles de limpiar para la reutilización y no se deterioran si se manipulan correctamente.

46 Espectrofotómetro de simple haz
En un instrumento de simple haz (beam), la luz pasa desde la fuente al monocromador o filtro y después por la cubeta que contiene la muestra para llegar al fotodetector.

47 Espectrofotómetro de doble haz
En un monocromador de sistema de doble haz (beam), la luz de un solo o de dobles monocromadores se enfoca a través de una referencia y un compartimiento de muestra. La intensidad de estos dos haces de luz se medida por cualquiera de los dos detectores, y el haz de la muestra se compara con el haz de la referencia proporcionalmente. Esta proporción puede ser alimentada a un metro o directamente en un instrumento registrador. El diseño de doble haz de los instrumentos o pueden usarse en doble haz en el espacio o doble haz en el tiempo. Sistema doble haz en el espacio Sistema doble haz en el tiempo

48 Aspectos a considerar Luz parásita Tiempo de calentamiento Fatiga
Repetibilidad de la lectura Longitud de onda Deterioro de la rejilla Baja energía Cubetas defectuosas ó rayadas

49 Fotometría de emisión de llama
Se usa en el laboratorio clínico para determinar sodio, potasio, y concentraciones de litio en fluidos biológicos, aunque el electrodo de Ion específico (ISE) está reemplazando esta tecnología rápidamente. Puede utilizarse para medir más de 50 elementos. Sin embargo, se emplea principalmente para determinar los metales alcalinos, cuya excitación requiere solo un aporte bajo de energía procedente de una llama de temperatura baja (propano-aire, o butano-aire) En años anteriores el calcio también fue analizado por fotometría de llama; sin embargo, los métodos químicos y instrumentos de ISE han reemplazado esta técnica hace tiempo para el calcio debido a los espectros de emisión múltiples e interferencia que eran muy difíciles corregir.

50 Principio En la fotometría de llama se dispersa una solución salina acuosa en el aire, la sal presente en las gotitas dispersas pasa al estado gaseoso calentado con la llama, y después se desintegra rápidamente en átomos gaseosos. Por encima de una temperatura crítica , los átomos absorben energía, que excita a los electrones dando estados energéticos mas elevados. Cuando los electrones excitados vuelven a sus estado original, emiten energía absorbida en forma de luz. La longitud de onda de la luz emitida ene la longitud de onda dada es proporcional al número de átomos metálicos excitados y puede medirse con un filtro óptico apropiado y un fotodetector. Este fenómeno puede utilizarse para medir más de 50 elementos, sin embargo se emplea solo para determinar los metales alcalinos, cuya excitación requiere solo un aporte bajo de energía procedente de una llama de temperatura baja (propano-aire o butano-aire).

51 Instrumentación El fotómetro de llama es un dispositivo que analiza soluciones calentadas y mide la longitud de onda e intensidad de su emisión. El diseño del instrumento no es complicado, pero los detalles de construcción deben ser precisos. Hay dos partes: el ensamblaje del pulverizador-quemador que debe introducir una cantidad constante de solución en la llama que debe quemar a una temperatura constante, y la parte del colorímetro debe medir el color y intensidad de la luz emitidas por la llama. Longitudes de ondas de los tres elementos más comunes. Li nm Roja Na 589 nm Amarilla K nm Violeta.

52 Principio electroquímico
Los instrumentos que se encuentran en esta clasificación, son aquellos donde para realizar la medición van a intervenir reacciones químicas, utilizando generalmente electrodos. La forma de vida de organismos fisiológicos depende de un modo balanceado de la actividad de una variedad de iones importantes y gases. Así la medida de sus concentraciones es una función analítica importante en el laboratorio clínico. El uso de reacciones electroquímicas en las determinaciones de la actividad de iones fue la primera aplicación para la medición del pH, pero poco después de esto la tecnología se fue extendiendo hasta incluir una variedad de electrólitos y gases.

53 Medida potenciométrica
Casi todos conductores de electricidad son metales o electrólitos donde la corriente es llevada por electrones o iones. Cuando la corriente pasa de un metal al electrolito o del electrolito al metal, el tipo de portador cambia normalmente de repente y ciertos fenómenos interesantes ocurren. Siempre que hay una interfase entre el metal e iones de ese metal en una solución se genera un potencial eléctrico. También se produce un potencial de electrodo cuando las concentraciones diferentes de un ion están separadas por una membrana que es semipermeable a ese ion. Los elementos no metálicos como el hidrógeno también tienen potenciales de electrodo. Los métodos potenciométricos están basados en la relación cuantitativa entre el potencial de una célula dado por la siguiente distribución de potencial: E celda = E referencia + E indicador + E de la unión Es imposible asignar un valor específico al potencial de cada sustancia porque depende de factores como la concentración y complejidad de la solución y de la temperatura, pero a cada uno puede asignarse un potencial de electrodo relativo de media-celda como el de hidrógeno que es 0.0 V. El potencial de media celda del Calcio es igual a V

54 Ejemplo: AVL 985-S Equipo totalmente automático.
Realiza microanálisis con tres canales para medir sodio, potasio, y litio por la tecnología del electrodo de ion selectivo.

55 Bibliografía “Instrumentación en el Laboratorio Clínico”
CD:\Medidas, Instrumentos y Equipos Medicos\materiales\INTRODUC.DOC “Analysis of Molecules in Clinical Medicine” CD:\BME310_2003\C3.DOC