MARCADORES ALELO ESPECÍFICOS: SSCP, CAPS, DAF, AP-PCR, MP-PCR Y STS INTEGRANTES Mendoza Cornejo Greta Milagros Serquen Zegarra Belén del Carmen DOCENTE.

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1 MARCADORES ALELO ESPECÍFICOS: SSCP, CAPS, DAF, AP-PCR, MP-PCR Y STS INTEGRANTES Mendoza Cornejo Greta Milagros Serquen Zegarra Belén del Carmen DOCENTE MSc. Jhon García López Genética aplicada 2021 - I

2 INTRODUCCION Los marcadores moleculares son biomoléculas desarrolladas a fines de los años 70 y que se basan en identificar proteínas o isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida, sin embargo esta técnica no era capaz de detectar suficientes polimorfismos entre variedades, debido a la proteína, ya que esta puede variar de unos tejidos a otros. Los avances en la tecnología del ADN recombinante permitieron el desarrollo de marcadores moleculares basados en el ADN, de tal manera consiguieron estabilidad en la identificación de especies y variedades. El número de tecnicas es cada vez más numerosas, por ello solo hablaremos de seis alelos específicos.

3 MARCADORES ALELOS ESPECIFICOS Un marcador permite el rastreo de una región específica de ADN. Son secuencias de ADN identificables, ubicadas específicamente en el genoma y transmisibles por las leyes estándar de herencia de una generación a la siguiente. La existencia de diversas técnicas moleculares y las diferencias en sus principios y metodologías requieren una consideración cuidadosa al elegir uno o más de esos tipos de marcadores.

4 PRINCIPALES VENTAJAS DE LA PCR EN COMPARACION CON LOS METODOS DE HIBRIDACIÓN  Se requiere una pequeña cantidad de ADN  Eliminación de radioisótopos en la mayoría de técnicas  La capacidad de amplificar las secuencias de ADN de tejidos.  Accesibilidad de la metodología para pequeños laboratorios en términos de equipo, instalaciones y costo.  No se requieren conocimientos previos de secuencia para muchas aplicaciones, como AP-PCR, RAPD, DAF, AFLP e ISSR.  Alto polimorfismo que permite generar muchos marcadores genéticos en poco tiempo.  La capacidad de cribar muchos genes simultáneamente ya sea para la recopilación directa de datos o como una viabilidad estudio previo a los esfuerzos de secuenciación de nucleótidos.

5 TIPOS DE MARCADORES ALELOS ESPECIFICOS Cebadores asociados a alelos específicos (ASAP) Oligonucleótidos aleo específicos (ASO) PCR alelo específica (AS-PCR) Polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) PCR cebada con microsatélites anclados (AMP-PCR) Repeticiones de secuencia simple ancladas (ASSR) Reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR) Secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS) Huellas dactilares de amplificación de ADN (DAF) Etiquetas de secuencia expresada (EST) PCR invertida (IPCR) Repeticiones etiquetadas de secuencia invertida (ISTR) PCR cebada con microsatélites (MP-PCR) Ensayo de diagnóstico específico de alelos multiplexados (MASDA) Polimorfismos de microsatélites amplificados aleatorios (RAMP) Microsatélites amplificados aleatorios (RAM), ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Amplificación selectiva de loci polimórficos de microsatélites (SAMPL) Regiones amplificadas caracterizadas por secuencia (SCAR) Polimorfismos de amplificación específicos de secuencia (S-SAP) Sitio de microsatélites con etiquetas de secuencia (STMS) Sitio etiquetado en secuencia (STS) Repeticiones cortas en tándem (STR) Polimorfismo de longitud de secuencia simple (SSLP) Repeticiones de secuencia simple (SSR) Reacciones de amplificación de un solo cebador (SPAR) Polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) Amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) Repetición en tándem de número variable (VNTR)

6 M ARCADORES AMPLIFICADOS ARBITRARIAMENTE DAF (Huella Dactilar de Amplificación de ADN) Es una técnica de perfilado de amplicones arbitrarios múltiples (MAAP) que utiliza uno o más cebadores aleatorios, ricos en GC y condiciones de amplificación no tan rigurosas, para producir patrones únicos y relativamente complejos, conocidos como “huellas dactilares. Estas huellas dactilares se visualizan correctamente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y una tinción de plata de alta sensibilidad para ADN. El DAF también se puede utilizar para estudiar mezclas complejas de organismos, como los que se encuentran en relaciones simbióticas o patógenas. Y puede generar marcadores moleculares para mapeo genético y aplicaciones de reproducción, así como para análisis de población y pedigrí.

7 Patrones DAF provenientes de aislados bacterianos

8 AP-PCR (PCR con Cebadores Arbitrarios) Es una técnica de screening de alteraciones basada en la huella genética obtenida en la misma PCR (Polymerase Chain Reaction) para distintos ADN procedentes de diferentes muestras, que pueden estar o no correlacionadas. Las ventajas más interesantes de la AP-PCR son su rapidez, flexibilidad, fácil interpretación y relativamente bajo coste. Existen diversos estudios que indican que la AP-PCR posee una baja reproducibilidad (sobre todo cuando se comparan patrones de bandas entre laboratorios diferentes), por lo que es recomendable que esta técnica se valide y se optimice en cada laboratorio.

9 Esquema de PCR cebada arbitraria (AP-PCR).

10 CAPS ( SECUENCIA POLIMÓRFICA AMPLIFICADA Y CORTADA ) CAPS es una combinación de PCR y RFLP y originalmente llamado PCR-RFLP. La técnica implica la amplificación de un ADN diana a través de PCR, seguida de digestión con enzimas de restricción, se basa en las diferencias en los patrones de digestión con enzimas de restricción de los fragmentos de PCR causados por la polimerización de nucleótidos entre muestras.

11 STS (Sequence- tagged site) Es una secuencia relativamente corta (200 a 500 pb), que puede amplificarse específicamente mediante PCR y detectarse en presencia de todas las demás secuencias genómicas y cuya ubicación en el genoma está cartografiada. Por tanto, en sentido amplio, los STS incluyen marcadores como microsatélites (SSR, STMS o SSRP), regiones amplificadas caracterizadas por secuencias (SCAR), secuencias polimórficas amplificadas y cortadas (CAPs) y repeticiones simples entre secuencias (ISSR).

12 La PCR basada en STS produce un patrón simple y reproducible en gel de agarosa o poliacrilamida. En la mayoría de los casos, los marcadores STS son codominantes, es decir, permiten distinguir los heterorocigotos de los dos homocigotos. Los STS son muy útiles para detectar microdeleciones en algunos genes.

13 SSCP (Single-strand conformation polymorphism) Los SSCP exploran las diferencias en las secuencias de ADN basadas en la separación electroforética de moléculas de ADN, inicialmente utilizadas para la detección de polimorfismos nuevos / conocidos y mutaciones puntuales.

14 Desventajas del uso de SSCP La influencia de otros factores que contribuyen a la conformación secundaria del ADN. No permite detectar cambios de nucleótidos precisos. No detecta la ausencia de mutaciones. La temperatura del gel de poliacrilamida puede influir en los patrones electroforéticos.

15 Usos : El uso de SSCP posee un enorme potencial para su aplicación en la diversidad de comunidades y poblaciones en entornos atípicos. También se ha utilizado esta técnica para la detección de las mutaciones en los genes relacionados a diversas patologías hereditarias.

16 MP-PCR (Microsatellite- primed PCR) Nació como una modificación RAPD, en donde se utilizaron como primers oligonucleótidos diseñados originalmente como sondas de hibridación para identificación de huellas dactilares de ADN para la identificación de mini y microsatélites. Estos primers se usaron para la amplificación de fragmentos de ADN altamente variables dentro del genoma de hongos de interés clinico

17 Al aplicar el uso de sondas de hibridación de huellas dactilares de ADN convencionales como cebadores únicos en la PCR se combinan las ventajas de la toma de huellas dactilares de ADN con las de la PCR. En este tipo de PCR se emplean los oligonucleótidos repetitivos únicos GACA 4, GTG 5 o la secuencia central de M13.

18 CONCLUSIONES El uso de marcadores alelo específicos tiene un amplio campo de aplicaciones, tanto en el estudio de poblaciones como en el área de diagnostico clínico. Debido a la similitudes y desventajas entre estas técnicas, algunas son poco usadas.

19 GRACIAS