BIOLOGÍA MOLECULAR EN HEMOGLOBINOPATÍAS

BIOLOGÍA MOLECULAR EN HEMOGLOBINOPATÍAS
RICARDO MOLINA GASSET HOSPITAL VIRGEN DE LOS LIRIOS MAYO 2019

BIOLOGÍA MOLECULAR HEMOGLOBINOPATÍAS
HEMOGLOBINA Proteína globular de 6,4 nm diámetro Estructura: 4 cadenas polipeptidicas de globina (2 alfa y 2 Beta) 4 grupos Hemo unidos por interacciones hidrofóbicas Concentración: 13 – 18 g/dl en el hombre y 12 – 16 g/dl en la mujer. Características: Transporte Oxígeno/CO2 Capacidad de “captar” y “ceder “ oxígeno Capacidad amortiguadora por captación de H+ Gran solubilidad Estados de la Hb en los globulos rojos: Oxihemoglobina (oxidada): rojo intenso *sangre arterial Dexosihemoglobina (reducida): rojo oscuro *sangre venosa

UNION DEL HEM A LA GLOBINA Y AL OXÍGENO El hierro se une la Hys F8 ( histidina proximal) Al otro lado se encuentra la Hys E7 (histidina distal) donde se une el O2, CO2 y CO El proceso se encuentra altamente conservado en todos los seres vivos. En humanos, esta vía metabólica sirve casi exclusivamente para la síntesis del hemo. En otras especies, además produce sustancias similares tales como la cobalamina. La vía se inicia con la síntesis de ácido D-aminolevulínico (dALA o δALA) a partir del aminoácido glicina y de succinil-CoA proveniente del ciclo del ácido cítrico. La enzima limitante de velocidad en esta reacción, la ALA sintasa, se encuentra regulada negativamente por la concentración de glucosa y hemo. Los mecanismos de inhibición de la ALAs por hemo o hemina se produce por medio de la disminución de la estabilidad de la síntesis de ARNm y por la disminución de la incorporación de ARNm en la mitocondria. Este mecanismo tiene una importancia terapéutica, la infusión de arginato de heme o hematina y glucosa puede abortar los ataques de porfiria intermitente aguda en pacientes con un error innato del metabolismo en este proceso. Y funciona reduciendo la transcripción de la ALA sintasa.6 Aunque todas las células precisan del grupo hemo para funcionar adecuadamente, los órganos principalmente involucrados en la síntesis del hemo son el hígado (en el cual la síntesis de hemo es altamente variable, dependiendo del contenido global de hemo del organismo) y la médula ósea (en la cual la tasa de producción de heme es relativamente constante, y depende de la producción de la cadena de globina). El hemo puede ser visto como una molécula intermediaria en el catabolismo de la hemoglobina que conduce a la producción de bilirrubina. Defectos en varias enzimas que participan en la síntesis del hemo pueden conducir a un grupo de enfermedades llamadas porfirias, entre las que se incluyen: porfiria intermitente aguda, porfiria congénita eritropoyética, porfiria cutánea tarda, coproporfiria hereditaria, porfiria variegata y la protoporfiria eritropoyética. Cada subunidad esta constituida por 8 hélices rotuladas AH conectadas por uniones polipeptídicas cortas

Los estudios de estructura han mostrado que la hemoglobina puede adoptar dos conformaciones, denominadas T (tensa) y R (relajada). La desoxihemoglobina (en azul) se encuentra en el estado T, y la unión del oxígeno (en rojo) provoca la transición al estado R. La animación muestra una vista cercana del grupo hemo (en blanco, bolas y varillas) de una de las subunidades de la hemoglobina. En el estado desoxigenado (T), el átomo de hierro no es coplanar con el resto del grupo hemo debido a su asociación con la cadena lateral de una histidina. La unión del oxígeno desplaza el átomo de hierro de modo que queda coplanar con el resto del grupo hemo, lo que a su vez arrastra la histidina, produciendo un cambio conformacional de mayor escala que afecta a toda la proteína. En las células rojas es crucial la presencia del 2,3-bisfosfoglicerato, ya que éste determina la afinidad de la hemoglobina con el dioxígeno. Para que la hemoglobina funcione eficientemente, el estado T debe permanecer estable hasta que la unión de suficientes dioxígenos permita la transición al estado R. El estado T es muy inestable; esto desplaza el equilibrio hacia el estado R. Esto resultaría en una baja liberación de dioxígeno en los tejidos. Por lo tanto es necesario un mecanismo adicional para estabilizar el estado T. Este mecanismo se descubrió a partir de la comparación de la afinidad con el dioxígeno de la hemoglobina en un estado puro y en las células rojas. Se encontró que en un estado puro la hemoglobina se enlaza fuertemente al dioxígeno, dificultando su liberación, mientras que en las células rojas su afinidad es menor. Esta diferencia se debe a la presencia del 2,3-bifosfoglicerato (2,3-BPG). Este compuesto está presente en las células rojas de la sangre a una concentración igual a la concentración de hemoglobina (~ 2 mM).

ΨΨEl conjunto de genes de las globinas tipo α está formado por un gen embrionario (ζ2) dos genes fetales/adultos (α2 y α1), varios seudogenes (ψ ζ1, ψ α2 y ψ α1) y un gen de función indeterminada (θ1) dispuestos en el siguiente orden: telómero-ζ2-ψζ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1-centrómero . Los dos genes estructurales α2 y α1 presentan una gran homología y ambos codifican para la cadena α globina, si bien la expresión de α2 es significativamente superior a la de α1. El conjunto de genes de las globinas tipo β está formado por un gen embrionario (ε), dos genes fetales (Gγ y Aγ), dos genes adultos (δ y β) y un seudogen (ψ β) dispuestos en el siguiente orden: telómero- LCR-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-centrómero. Proninciacion ζ gepta Pronunciacion Ψ fi

Como resultado de la síntesis de las diferentes cadenas de globina en los diferentes estadios de la vida, existen diferencias en el tipo de hemoglobina (Hb) que encontraremos en los glóbulos rojos entre la etapa adulta y el período fetal y neonatal. En la etapa adulta, la HbA constituye entre el 96% y el 98% de la Hb total, la HbA2 constituye entre el 2,0 % y 3,5 % y la Hb Fetal constituye menos del 2 % de la Hb total. En cambio, en el recién nacido aproximadamente el 80 % de su hemoglobina está constituida por Hb Fetal, la HbA constituye un 20 % del total y la HbA2 menos del 1 %. Sin embargo, tras el momento del nacimiento, el incremento en la síntesis de cadena β y la disminución de cadena γ, harán que el recién nacido presente porcentajes de hemoglobina idénticos a los de la etapa adulta en el primer año de vida

Hb adulta- HbA1: 2  y 2  (96%) Hb adulta- HbA2: 2  y 2 Δ (3%) Hb fetal- HbF: 2  y 2  (1%)

ALTERACIONES CUALITATIVAS Hemoglobinopatías estructurales ALTERACIONES CUANTITATIVAS Síndromes Talasémicos Caracteristicas: Formas sin sintomatología, leves y formas mas graves como los síndromes talasémicos y enfermedad células falciformes Enfermedades hederitarias monogénicas mas comunes en el mundo Autosómicas, mayoritariamente recesivas Problema de salud púbica en: Sudeste asiático, oriente medio, mediterraneo, subcontinente indio, Africa y Caribe 250 millones personas potencialmente portadores de una hemoglobina patológica Las hemoglobinopatías constituyen un grupo muy heterogéneo de enfermedades hereditarias autosómicas, mayoritariamente recesivas, debidas a una alteración en la síntesis de las cadenas de globina que forman la hemoglobina (Hb) por mutaciones puntuales, inserciones o deleciones en los genes que las codifican. De forma que cuando esta alteración es cualitativa por un cambio de aminoácido o aminoácidos en la estructura de la cadena se denominan hemoglobinopatías estructurales y cuando es cuantitativa, porque existe una disminución o ausencia de una o más cadenas de globina, se denominan talasemias. También existe un tercer grupo conocido como hemoglobinopatías talásemicas, en el que se combina el efecto cualitativo y cuantitavo, es decir se produce menos cantidad de una Hb estructuralmente anómala.

Clasificación: ESTRUCTURALES Cadenas  Cadenas  Cadenas  Cadenas  Fusión de Cadenas:    TALASEMIAS - talasemia - talasemia - talasemia - talasemia - talasemia PERSISTENCIA HEREDITARIA DE HEMOGLOBINA F Con deleción Sin deleción Ligado al cluster  No Ligado al cluster  Existen diferencias fenotípicas, tanto en la cantidad de hemoglobina F producida como en la relación de las cadenas Gγ / Aγ que contienen. El análisis molecular de las condiciones con PHHF ha demostrado que en algunos casos el “cluster” de β globina está intacto (PHHF-no deleción), mientras que en otros existen deleciones que afectan el extremo 3´ del “cluster” con remoción completa de los genes δ y β (PHHF deleción).

Clasificación según patología molecular: Sustituciones de una única base. HbS, HBC, Hb E Variantes de cadena de hemoglobina elongadas (cadenas alargadas). Hb CS Cadenas de globinas truncadas (deleción de fragmentos). Hb Leiden, Gun Hill Hemoglobinas de fusión (hibridización anómala). Hb Lepore Talasemias

Clasificación según Fenotipo
BIOLOGÍA MOLECULAR HEMOGLOBINOPATÍAS Clasificación según Fenotipo I-Propiedades físico-químicas alteradas -HbS (polimerización deoxihb S): síndromes drepanocíticos -HbC (cristalización): anemia hemolítica, microcitosis II-Variantes de Hemoglobina Inestables -Anemia hemolítica de cuerpos de Heinz Congénita III- Variantes con afinidad al O2 alterada -Variantes con alta afinidad: eritrocitosis -Variantes con baja afinidad: anemia, cianosis IV-Hemoglobina M -Metahemoglobinemia, cianosis. V- Variantes que causan un fenotipo talasémico

I-Propiedades físico-químicas alteradas Defecto de carácter hereditario Tiene como consecuencia una estructura anormal en una de las cadenas de las globina Simple cambio de un aminoácido en una de las cadenas de globina Se han descrito mas de 1300 variantes Mayoría variantes asintomáticas Afectación de la cadena beta (gen HBB) son más frecuentes y con mayor significado clínico La HbS, responsable de la ECF, así como la HbC, HbD y HbE se agrupan en el conjunto de hemoglobinopatías con alteración de carga superficial, las cuales se caracterizan por presentar cambios aminoacídicos en la superficie de la molécula con carga eléctrica diferente a la normal. Debido a ello este grupo de hemoglobinopatías pueden detectarse fácilmente en la práctica clínica mediante técnicas de fraccionamiento de hemoglobinas, como la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) o la electroforesis capilar.

Hemoglobina S Cambio en el codón GAC normal que pasa a GTG de la cadena Beta Homocigoto anemia células falciformes HbS combinada con otras hemoglobinopatías o genes talasémicos da lugar a síndromes falciformes o drepanocíticos Glóbulo rojo en forma de hoz

Anemia Falciforme o Drepanocítica. Pauling, 1949 Enfermedad hereditaria, autosómica recesiva Raza negra La anomalía se sitúa en la cadena beta, cuya glutamina es sustituida por valina Primeros síntomas después de 3 meses debido al efecto protector de la HbF

A pesar que el genotipo más frecuente es el estado homocigoto de la HbS, cabe destacar en el caso de identificación de parejas de riesgo, la combinación entre la HbS y la β-talasemia, defecto este último prevalente en el área mediterránea, y que tiene como consecuencia un síndrome de características clínicas con gravedad similar al homocigoto S. Los problemas diagnósticos en el caso de los síndromes falciformes aparecen cuando la hemoglobinopatía S se asocia a genes talasémicos u otras hemoglobinopatías estructurales que no pueden ser discriminados mediante el fraccionamiento de hemoglobinas, como es el caso del doble heterocigoto HbS/β0 talasemia que presenta el mismo patrón de hemoglobinas que el homocigoto S. En estos casos, se recomienda realizar siempre que sea posible el estudio familiar del paciente con el objetivo de separar los defectos genéticos y facilitar su identi- ficación. A nivel genético el diagnóstico diferencial se puede realizar mediante la caracterización genética de los alelos implicados. Para la identificación de mutaciones puntuales responsables de la HbS, otras hemoglobinopatías estructurales frecuentes en el genotipo de la ECF, como la HbC o D, y mutaciones puntuales responsables de β- talasemia se utiliza la secuenciación SANGER de las regiones promotora, exónicas e intrónicas flanqueantes del gen de la β globina HBB, o bien técnicas alelo específicas como ARMS, RFLP o RT-PCR. Cabe destacar que, en ausencia de estudio familiar, la interpretación de los resultados obtenidos mediante ARMS, RFLP o RT-PCR debe tener en cuenta la posibilidad de falsos positivos para la homozigosis de la HbS cuando ésta se encuentre combinada con un alelo HBB afectado por una β-talasemia que englobe el codon 6, o una gran deleción como en el caso de la δβ -talasemia o la persistencia hereditaria de la HbF. En el caso de usar la secuenciación SANGER discriminaríamos la presencia de mutaciones puntuales responsables de β-talasemia pero no la de grande deleciones.

Vaso-oclusión Flujo de sangre lento Adherencia de los eritrocitos al endotelio La desoxigenación de las células produce salida de potasio de los glóbulos rojos, lo cual aumenta la densidad de los glóbulos y la tendencia de la HbS a polimerizarse El componente hemo tiende a liberarse de la proteína debido a la polimerización de la hemoblobina S. Hemolisis crónica

Anemia Falciforme, Drepanocítica, en Forma de Hoz (sickle), o HbS
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Vaso-oclusión y hemolisis: Varia entre pacientes Dos modificadores principales Capacidad innata para producir HbF Coexistencia con alfa talasemias Las técnicas de secuenciación masiva han identificado variantes genéticas en las que está modulada la expresión clínica de la ECF

Hemoglobina C Se caracteriza por la sustitución del ácido glutámico de la cadena beta por lisina El estado homocigoto (CC) se caracteriza por una ligera anemia hemolítica crónica con esplenomegalia; la vida media del eritrocito esta disminuida El estado heterocigoto (AC) no produce trastorno alguno. Sus síntomas incluyen un mayor riesgo de que se produzcan infecciones y un bazo agrandado

Hemoglobina D Mutación Ácido glutámico por glutamina D-los Ángeles = D-Punjab Mas de 7 diferentes Hb D de acuerdo a la posición de la mutación) Frecuencia – localización: Anormalidad normalmente en India. Signos Clínicos y biológicos : Heterocigota: Asintomática, Fracción Hb A: 65 – 70 % , Fracción Hb D:30 – 35 % Homocigota: Anemia muy ligera Ausencia de fracción Hb A Fracción Hb D 100 % Ver si pongo hemoglobina D

II-Variantes de Hemoglobina Inestables Las hemoglobinopatías inestables obedecen a mutaciones en la zona de unión de globina-hemo que desestabilizan la molécula de Hb. Se facilita su desnaturalización y la formación de precipitados intraeritrocitarios. Patrón de herencia es autosómico dominante Reducción de la vida media del eritrocito. Anemia hemolítica crónica de intensidad variable Crisis de agudización en procesos infecciosos febriles y/o tras la ingesta de medicamentos oxidantes. Se han descrito hasta 151 mutaciones responsables de hemoglobinopatías inestables en los genes α1, α2 y β globinas Las mutaciones “de novo” son relativamente frecuentes. Las hemoglobinopatías inestables obedecen a mutaciones que desestabilizan la molécula de Hb facilitando su desnaturalización y la formación de precipitados intraeritrocitarios. patrón de herencia es autosómicodominante y es responsable de una reducción de la vida media del eritrocito y una anemia hemolítica crónica de intensidad variable, con crisis de agudización en procesos infecciosos febriles y/o tras la ingesta de medicamentos oxidantes. La mutación en este tipo de hemoglobinopatía consiste en un cambio de aminoácido en la zona de unión globina-hemo, produciendo desnaturalización y precipitación de las cadenas de globina. Se trasmiten con carácter autosómico dominante y cursan con un cuadro de anemia hemolítica crónica de intensidad variable. El grado de hemólisis depende del tipo de mutación y su efecto puede verse agudizado por factores diversos tales como la ingesta de ciertos medicamentos oxidantes (sulfamidas) o infecciones. La tinción con colorantes supravitales, da a los hematíes un aspecto característico, por lo que estas anemias se denominaban antiguamente anemias hemolíticas con cuerpos de Heinz positivos. Se conocen actualmente más de 100 Hb inestables.

HBB c.128T>C clínica grave. HBB c.295G>A clínica leve Las hemoglobinopatías inestables obedecen a mutaciones que desestabilizan la molécula de Hb facilitando su desnaturalización y la formación de precipitados intraeritrocitarios. patrón de herencia es autosómicodominante y es responsable de una reducción de la vida media del eritrocito y una anemia hemolítica crónica de intensidad variable, con crisis de agudización en procesos infecciosos febriles y/o tras la ingesta de medicamentos oxidantes.

Características de algunas hemoglobinas inestables

Anemia Hemolítica de Cuerpos de Heinz Congénitos, (CHBA) (Congenital Heinz body hemolitic anemia) Tipo 1: Sustituciones en la vecindad del bolsillo del hem. La unión del hem a la globina involucra interacciones específicas con residuos de aminoácido no polares en las regiones CD, E, F, y FG

Anemia Hemolítica de Cuerpos de Heinz Congénitos, (CHBA) (Congenital Heinz body hemolitic anemia) Tipo 5 Tipo 2: Ruptura Estructura Secundaria de -hélice. Prolina no puede participar excepto como parte de uno de los tres residuos iniciales. Hay sustituciones de Pro Tipo 3 Tipo 4 Tipo 3: Mutaciones en la interfaz 11 Tipo 4 : Deleciones de aminoácidos Tipo 2 Tipo 5: Cadenas Elongadas

III- Variantes con afinidad al O2 alterada Son debidas a mutaciones que afectan a regiones de la molécula relacionadas con los cambios conformacionales que se producen en el proceso de fijación reversible del oxígeno. Hemoglobinas con alta afinidad por el oxígeno: Más frecuentes Cursan con una eritrocitosis como consecuencia de la hipoxia tisular (ejemplo la Hb Barcelona HBB c.283G>C) Hemoglobinas de baja afinidad: Disminución en el número de hematíes y de hemoglobina (falsa anemia), (ejemplo la Hb Vigo HBB c.200A>T) lobinopatías de alta o baja afinidad son debidas a mutaciones que afectan a regiones de la molécula relacionadas con los cambios conformacionales que se producen en el proceso de fijación reversible del oxígeno. Las más frecuentes son las hemoglobinas con alta afinidad por el oxígeno que cursan con una eritrocitosis como consecuencia de la hipoxia tisular, como la Hb Barcelona HBB c.283G>C hemoglobinas de baja afinidad, se produce una disminución en el número de hematíes y de la concentración de hemoglobina (falsa anemia), como en el caso de la Hb Vigo HBB c.200A>T. El ácido 2,3-bisfosfoglicérico (2,3-BPG) es un isómero del 1,3-BPG, metabolito que interviene en la glucólisis. También está presente en los glóbulos rojos, que lo sintetizan por un desvío de la ruta glucolítica, en una concentración cercana a 5 mmol/L, actuando como modulador alostérico de la hemoglobina. La unión del 2,3-BPG con la desoxihemoglobina disminuye la afinidad de ésta por el oxígeno, favoreciendo la liberación de este gas en los tejidos más necesitados de él.

lobinopatías de alta o baja afinidad son debidas a mutaciones que afectan a regiones de la molécula relacionadas con los cambios conformacionales que se producen en el proceso de fijación reversible del oxígeno. Las más frecuentes son las hemoglobinas con alta afinidad por el oxígeno que cursan con una eritrocitosis como consecuencia de la hipoxia tisular, como la Hb Barcelona HBB c.283G>C hemoglobinas de baja afinidad, se produce una disminución en el número de hematíes y de la concentración de hemoglobina (falsa anemia), como en el caso de la Hb Vigo HBB c.200A>T. El ácido 2,3-bisfosfoglicérico (2,3-BPG) es un isómero del 1,3-BPG, metabolito que interviene en la glucólisis. También está presente en los glóbulos rojos, que lo sintetizan por un desvío de la ruta glucolítica, en una concentración cercana a 5 mmol/L, actuando como modulador alostérico de la hemoglobina. La unión del 2,3-BPG con la desoxihemoglobina disminuye la afinidad de ésta por el oxígeno, favoreciendo la liberación de este gas en los tejidos más necesitados de él.

IV-Hemoglobina M o metahemoblobina El ion ferroso (Fe2+) del grupo hemo se oxida al estado férrico (Fe3+). Esto convierte la hemoglobina en metahemoglobina. Causa una disminución de la capacidad de liberar oxígeno a los tejidos (hipoxia) La formación espontánea de metahemoglobina se reduce normalmente a través de la donación de electrones por la NADH metahemoglobinareductasa o el ácido ascórbico o los sistemas de enzimas glutatión Los sistemas enzimáticos de protección, mantienen los niveles de metahemoglobina a menos del 1%. Metahemoglobinemia congénita Autosomico recesivo Debido a una deficiencia de la enzima NADH metahemoglobina reductasa Metahemoglobinemia adquirida. La exposición a drogas exógenas oxidantes y sus metabolitos (benzocaina, dapsona, nitratos) aceleran la velocidad de formación de metahemoglobina hasta mil veces, superando el sistema protector de enzimas.

Estudio molecular hemoglobinopatías estructurales La HbS, HbC, HbD y HbE se agrupan en el conjunto de hemoglobinopatías con alteración de carga superficial Presentan cambios aminoacídicos en la superficie de la molécula con carga eléctrica diferente a la normal. Pueden detectarse mediante HPLC, electroforesis en geles o la electroforesis capilar. Homocigoto de la HbS, facil detectable Doble heterocigoto HbS/β0: Gravedad similar al homocigoto S. Dificil diagnóstico (=patrón de HbS que el homocigoto S) Realizar siempre que sea posible el estudio familiar del paciente con el objetivo de separar los defectos genéticos y facilitar su identificación

Para identificar mutaciones puntuales de hemoglobinopatías estructurales: Secuenciación SANGER de las regiones promotora, exónicas e intrónicas flanqueantes del gen de la β globina Si se asocia con beta talasemia discriminaríamos la presencia de mutaciones puntuales responsables de β-talasemia pero no la de grandes deleciones Técnicas alelo específicas como ARMS, RFLP o RT-PCR. En ausencia de estudio familiar, la interpretación de los resultados: Mediante ARMS, RFLP o RT-PCR posibilidad de falsos positivos para la homozigosis de la HbS : HbS se encuentre combinada con un alelo β afectado por una β-talasemia que englobe el codon 6 Gran deleción como en el caso de la δβ -talasemia Persistencia hereditaria de la HbF.

Talasemias Defecto en las cadenas alfa y/o beta. Mas de 500 mutaciones responsables de talasemia Mutaciones puntuales/deleciones de los genes de las globinas: Ausencia o disminución de la síntesis de las cadenas de globina Desequilibrio en la síntesis de las cadenas Los síndromes graves: afectos 2 genes β, o bien 3-4 de los genes α Efectos patológicos asociados: Daño en los precursores eritroides Eritropoyesis inefectiva Daño en los eritrocitos maduros Anemia hemolítica. Microcitosis Hipocromia La talasemia constituye un grupo heterogéneo de defectos congénitos de la hemoglobina con expresividad clínica variable. Obedece a mutaciones puntuales o deleciones de los genes de las globinas que provocan la ausencia o disminución de la síntesis de las cadenas de globina normales. En los síndromes talasémicos, la disminución en la síntesis de un tipo de cadena globínica conduce a un desequilibrio en la síntesis de las cadenas, con un exceso de la síntesis de una de las cadenas normales que contribuye a los efectos patológicos asociados, causando tanto daño en los precursores eritroides y una eritropoyesis inefectiva, como daño en los eritrocitos maduros y una anemia hemolítica. Los principales tipos de talasemia clasificados de acuerdo a su genotipo se muestran en la tabla 2 Se han descrito casi 500 mutaciones responsables de talasemia, las mutaciones en los genes α o β presentan potencialmente una repercusión clínica, ya que tienen como consecuencia lareducción de la hemoglobina A. Los síndromes graves aparecen normalmente sólo cuando están afectos los dos genes β, o bien tres o cuatro de los genes α. Las formas más estudiadas y clínicamente más importantes de talasemia son la α-talasemia, la β-talasemia, y la δβ-talasemia. Cada una de ellas puede clasificarse a su vez según si existe una síntesis deficiente o parcial de la cadena de globina afectada (α+, β+, δβ+) o una ausencia total de síntesis de la misma (α0, β0, δβ0). Se dividen en: 1.Alfa talasemias 2.Beta talasemias

Talasemias alfa Hay mutaciones en la cadena alfa de la hemoglobina 2 genes de la cadena alfa en cada cromosoma 16 (4 en total) Deleción de una gran parte o de todo un gen Tipos de talasemia alfa: 1. El portador silencioso 2. Talasemia α menor 3. Hemoglobina H 4. Talasemia α mayor

El portador silencioso Más leve Solo un gen de globina α ausente anormal No síntomas Transmitir la enfermedad a sus hijos.

Talasemia alfa menor 2 genes de globina α anormales o ausentes No síntomas importantes Anemia leve Transmitir la enfermedad a sus hijos.

Hemoglobina H 3 genes de globina α ausentes o anormales Anemia de leve a moderada, con riesgo hemolisis por:. -Infecciones virales -Fármacos oxidantes: trimetroprim/sulfametoxazol, dapsona, nitrofurantoína, etc Agrandamiento del bazo y cálculos biliares.

Talasemia alfa mayor Más grave No hay genes Anemia grave, insuficiencia cardíaca y acumulación de líquidos. Nacen sin vida o mueren pocas horas Transfusiones de sangre de por vida

El mecanismo molecular de la α-talasemia es predominantemente por grandes delecciones: Afectan a un solo gen α globina (α1 o α2), deleciones -3.7Kb y -4.2Kb, conocidas como mutaciones α+. Ambos genes α globina (α1 y α2), mutaciones -MED; -MEDII, -SEA; -FIL; -THAI; -20.5, DUTCH I, conocidas como mutaciones α0. Para la identificación de grandes delecciones se usan técnicas alelo específicas: GAP-PCR, múltiple o sencilla, MLPA para cribado de grandes delecciones no conocidas. Como consecuencia, conocer el origen del paciente es de gran relevancia para asegurar un correcto diagnóstico genético, especialmente cuando se utilizan técnicas alelo específicas que no cubren el 100% de las mutaciones.

Una minoría se producen por mutaciones puntuales: Las que afectan al gen α2 son más graves que las que afectan al gen α1 y a las α1 deleción, ya que el gen α2 se expresa entre 2-3 veces más que el gen α1. Las mutaciones α globina no delecionales pueden caracterizarse mediante: Secuenciación SANGER de las regiones promotora, exónicas e intrónicas flanqueantes de los genes α1 y α2 globina Mediante técnicas dirigidas a identificar mutaciones concretas como RFLP. Como consecuencia, conocer el origen del paciente es de gran relevancia para asegurar un correcto diagnóstico genético, especialmente cuando se utilizan técnicas alelo específicas que no cubren el 100% de las mutaciones.

Distribución geográfica de las mutaciones responsables de α-talasemia Como consecuencia, conocer el origen del paciente es de gran relevancia para asegurar un correcto diagnóstico genético, especialmente cuando se utilizan técnicas alelo específicas que no cubren el 100% de las mutaciones.

Talasemias beta Mecanismo molecular a mutaciones puntuales: Sustituciones de una única base nitrogenada Deleciones o inserciones muy cortas que alteran la transcripción o la maduración del RNAm. Dentro de los síndromes β-talasémicos se encuentran asociaciones entre genes β-talasémicos y genes δβ-talasémicos, como la Hb Lepore. Ocho mutaciones se consideraban responsables de más del 90 % de las β-talasemias de la región mediterránea. Los flujos inmigratorios han variado el mapa mutacional de la β-talasemia en España, incrementando su heterogeneidad molecular. Como consecuencia, conocer el origen del paciente es de gran relevancia para asegurar un correcto diagnóstico genético, especialmente cuando se utilizan técnicas alelo específicas que no cubren el 100% de las mutaciones.

Talasemias beta Existe un gen para la cadena beta en cada cromosoma número 11, con un total de dos genes. 3 formas principales: La talasemia Leve La talasemia Intermedia La talasemia Grave

La talasemia Leve o minor Denominada rasgo talasémico Causada por una mutación en un gen de globina beta. La mayoría de las personas afectadas no presenta síntomas aunque algunas padecen anemia leve. Las personas afectadas pueden transmitir el gen anormal a sus descendientes.

La talasemia Intermedia Resultado de anomalías en ambos genes de globina beta. Son menos graves que las que causan la talasemia mayor. Los niños afectados padecen anemia de leve a moderada, presentan agrandamiento del bazo y anomalías en los huesos. Necesitan transfusiones de sangre para reducir las complicaciones.

La talasemia Grave o mayor Forma más grave Resultado de mutaciones graves en ambos genes de globina beta. También se denomina “anemia de Cooley”. La mayoría de los niños afectados parecen saludables al nacer. No obstante, durante el primer o el segundo año de vida se vuelven pálidos e irritables y pierden el apetito. Su crecimiento es lento y a menudo tienen ictericia (su piel y sus ojos adquieren un color amarillento).

Distribución geográfica de las mutaciones responsables de β-talasemia. Como consecuencia, conocer el origen del paciente es de gran relevancia para asegurar un correcto diagnóstico genético, especialmente cuando se utilizan técnicas alelo específicas que no cubren el 100% de las mutaciones.

Delta-Beta talasemia Causada por deleciones de los genes delta y beta con aumento de síntesis de cadenas gamma y aumento de HbF Descrita en muchos grupos étnicos, es muy frecuente en Grecia, Italia y España. Heterocigotos asintomáticos, con microcitosis leve y sin reducción de la HbA2 . Homocigotos tienen una presentación clínica leve. Hereda conjuntamente con la beta-talasemia clásica (doble heterocigoto), los pacientes suelen presentar el fenotipo de talasemia intermedia. Muy relacionada con la persistencia hederitaria hemoglobina fetal

La técnica de elección actual: Secuenciación SANGER de las regiones promotora, exónicas e intrónicas flanqueantes del gen de la β globina Se han dejado de usar técnicas dirigidas a identificar mutaciones concretas como ARMS-PCR o RFLP. De utilizar técnicas alelo específicas, es importante conocer el origen étnico del paciente. Considerar grandes deleciones que afectan al gen o al cluster β globina: -619bp,δβ Spanish, HPFH-1, HPFH-2, HPFH-3, HPFH-7, Lepore. Para identificar grandes deleciones se usan técnicas alelo específicas: GAP-PCR, múltiple o sencilla, MLPA para cribado de grandes deleciones no conocidas. Como consecuencia, conocer el origen del paciente es de gran relevancia para asegurar un correcto diagnóstico genético, especialmente cuando se utilizan técnicas alelo específicas que no cubren el 100% de las mutaciones.

Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal Producción de Hb F en el adulto que excede el nivel normal en ausencia de cualquier cambio hematológico mayor. Existen diferencias fenotípicas: Cantidad de hemoglobina F producida Relación de las cadenas Gγ / Aγ que contienen. El análisis molecular de la PHHF ha demostrado: Casos con deleciones que afectan el extremo 3´ del cluster con remoción completa de los genes δ y β (deleción). Casos con el cluster de β globina está intacto (no deleción)

Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal tipo deleción Son la mayoría de los casos Se debe a la pérdida de cantidad variable de material genético que incluye generalmente los genes δ y β. Gγ Aγ PHHF es muy similar a la Gγ Aγ δβ talasemia, aunque los heterocigotos tienen mayor nivel de Hb F Homozigotos tienen un cuadro hematológico y síntesis de globina similar a la talasemia β heterocigota (con 10% de Hb F) La condición con deleción se puede dividir: Gγ Aγ (δβ)0-PHHF Hb Kenya-PHHF Gγ Aγ (δβ)0-talasemia Gγ (Aγ δβ)0- talasemia (ε Gγ Aγ δβ)0-talasemia. En cada grupo el cuadro clínico y hematológico es relativamente uniforme. Son la mayoría de los casos y se debe a la pérdida de cantidad variable de material genético que incluye generalmente los genes δ y β. Gγ Aγ PHHF es muy similar a la Gγ Aγ δβ talasemia, excepto que en heterocigotos tienen mayor nivel de Hb F y en homocigotos tienen un cuadro hematológico y síntesis de globina similar a la talasemia β heterocigota, con 10% de Hb F y también distribución heterogénea. La condición con deleción puede ser ampliamente dividida en Gγ Aγ (δβ)0-PHHF, Hb Kenya-PHHF, Gγ Aγ (δβ)0-talasemia, Gγ (Aγ δβ)0- talasemia y (ε Gγ Aγ δβ)0-talasemia. Cada grupo, con la excepción de Hb Kenya-PHHF, puede ser subdividido posteriormente a nivel molecular, pero dentro de cada grupo el cuadro clínico y hematológico es relativamente uniforme.

Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal tipo no deleción Muchas variantes en las que la mutación de una única base dentro o fuera del grupo de genes γ−δ−β origina el trastorno. En estos casos la producción de cadena γ deriva casi completamente de uno de los dos genes γ. El gen β sobre el cromosoma afecto está expresado en forma correcta. Según la distribución de la Hb F en los hematíes: PHHF: PHHF homogénea o pancelular con aumento uniforme de Hb F en todos los hematíes. PHHF heterocelular, en la cual sólo una subpoblación de hematies contiene Hb F. Se han descrito muchas variantes en las que la mutación de una única base dentro o fuera del grupo de genes γ−δ−β origina el trastorno. En estos casos la producción de cadena γ deriva casi completamente de uno de los dos genes γ. El gen β sobre el cromosoma afecto está expresado en forma correcta. Según la distribución de la Hb F en los hematíes, determinado por la técnica de elución ácida de Kleihauer, se pueden distinguir dos formas de PHHF: PHHF homogénea o pancelular con aumento uniforme de Hb F en todos los hematíes. PHHF heterocelular, en la cual sólo una subpoblación deglóbulos rojos contiene Hb F. A este grupo pertenecen los tipo deleción y están estrechamente relacionados con las δβ talasemias.

Hemoglobinopatías Talasémicas Mutaciones de los genes de globina que, además de producir una disminución en la síntesis de cadenas globínicas, son responsables de alteraciones estructurales: HbE Hb Lepore Hemoglobinopatías con alargamiento de la cadena de globina (Hb Constant Spring, Hb Tak) Hemoglobinopatías con cadenas de globina muy inestables (Hb Showa-Yakushiji, Hb Houston, Hb Geneva, Hb Quong Sze, Hb Suan Dok, Hb Petah, Hb Lleida, Hb Clinic).

Hemoglobina E Sustitución en la cadena de β-globina de ácido glutámico por lisina en la posición 26. Defecto en la maduración del RNAm y disminución en la síntesis de cadenas de β-globina. La segunda hemoglobina anómala más común después de la hemoglobina S Expresividad clínica es superponible a la β-talasemia minor: los heterocigotos microcitosis y los homocigotos microcitosis y una ligera anemia. Cuando la Hb E se asocia a un gen β- talasémico, la expresividad clínica es de una β-talasemia intermedia siendo la gravedad es muy variable La Hb E se halla principalmente en la población del sudeste asiático (> 15% de incidencia de enfermedad homocigota). Ver si pongo hemoglobina D

Hemoglobina Lepore Formación de un gen híbrido β, constituida por un fragmento δ y uno β. Cromosoma Lepore: gen β ha sido sustituido por el gen híbrido δβ Cromosoma anti-Lepore: gen híbrido βδ coexiste con los genes δ y β normales. Entrecruzamiento puede producirse en diferentes lugares, existen varios tipos de Hb Lepore (Boston, Baltimore y Hollandia). Variante más frecuente es la Hb Lepore Boston, incidencia elevada en determinadas áreas geográficas de Italia y centro de Europa. Comportamiento clínico es superponible al de una β-talasemia: Heterocigoto: caracteristicas β-talasemia minor pero sin aumento de HbA2 ni de la HbF. Homocigoto: características clínicas de una talasemia mayor.

Hemoglobinas de fusión Hemoglobina Lepore Hemoglobina Kenya -El gen híbrido δβ se llama Lepore y El gen híbrido βδ se llama anti-Lepore Hb Lepore tiene los primeros 20 a 80 aminoácidos de las cadenas  y los últimos 50 a 100 aminoácidos del extremo C-terminal de la cadena .

Mutantes de Terminación: Cadenas Alargadas Los mutantes de terminación son todos variantes de la cadena alfa globina donde hay una única sustitución de base en el codón stop UAA .

Variantes de cadena de Hb elongadas. Una mutación con desplazamiento, desfase o cambio del marco de lectura (también conocida como error de marco ocambio de marco) es un tipo de mutación causada por la inserción o deleción de un número de nucleótidos que no es múltiplo de tres en una secuencia de ADN. La síntesis de todas la proteínas comienza con el aminoácido metionina. La señal para iniciar una cadena pollipeptidica es un codón de iniciación especial que marca el comienzo del marco de lectura. Usualmente el codón de iniciación es el triplete AUG, pero en bacterias, GUG (½ especificidad que AUG) ó UUG (¼ especificidad que AUG) se pueden usar también.

Cadenas de globinas truncadas Uno o más aminoácidos adyacentes se pierden, pero se conserva el resto de la cadena normal. Estas variantes involucran la deleción de 1 o más codones intactos, no afectando el marco de lectura de la proteína restante. Son ejemplos de deleciones : Hb Freiburg (deleción de un aminoácido) Hb Lyon (deleción de dos aminoácidos) Hb GunHill (deleción de cinco aminoácidos)

FIN

La PCR-ARMS está basada en el mismo principio que ASO (Allele Specific Oligonucleotide): la utilización de oligonucleótidos específicos para la secuencia normal y para la secuencia mutada; en la PCR-ARMS estos oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se diseñan, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un mismo cebador común pero se diferencian en que un cebador amplificará sólo el alelo normal, mientras que el otro cebador amplificará sólo el mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está desplazando cada vez más a la técnica de ASO.5 Dicho de otra forma, una PCR ARMS estándar consiste en dos reacciones complementarias (dos tubos) y utiliza 3 cebadores. Un cebador es constante y complementarios a la plantilla en ambas reacciones, los otros cebadores difieren en sus extremos 3' y son específicos para la secuencia de ADN de tipo normal o la secuencia mutada en una base dada. Los productos de PCR se separan por electroforesis a través de un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio. Si la muestra es homocigótica para el alelo normal u homocigótico para el alelo mutante, sólo se producirá sólo en uno de los tubos, si la muestra es heterocigótica se verá en ambos tubos.6

PCR TIEMPO REAL

METODO SANGER El método comienza una vez que se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador (denominado “primer” en inglés), que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la ADN polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados. A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de ADN de distintas longitudes, todas las cuales terminan en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, se cargan en un gel de poliacrilamida y se someten a electroforesis. Así obtendremos un patrón de bandas en orden, del cual es posible deducir la secuencia del ADN introducido.

Se extrae el ADN y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la técnica molecular Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa a través del cual corren debido a un campo eléctrico y su disociación obedece a la masa o a la carga eléctrica de las muestras según la técnica utilizada. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de restricción varían.Por tanto, se trata de un técnica codominante ya que nos permite distinguir individuos homocigotos de aquellos heterocigotos, es decir, nos permite observar cada uno de los alelos que estudiamos. En el gel podemos observar que hay dos alelos de distinto tamaño, y nos permite distinguir entre ambos individuos.

GAP-PCR, múltiple o sencilla, MLPA p

MLPA MLPA es una técnica de biología molecular, (Multiplex PCR), que permite que en una misma reacción se pueda detectar copias anormales de hasta 50 secuencias genómicas diferentes de ARN o ADN. La técnica de MLPA se basa en una primera reacción de unión-ligación de sondas con la zona homóloga de interés; sólo las sondas que hayan hibridado podrán ser ligadas, y posteriormente amplificadas por PCR. Mediante un análisis de fragmentos y aprovechando la diferencia de tamaño de cada una de las sondas, se podrán identificar aberraciones en el número de copias genómicas. La técnica MLPA posee muchas aplicaciones, incluyendo la detección de mutaciones, el análisis de perfiles de metilación, la cuantificación relativa de ARNm, la caracterización cromosómica de líneas celulares y muestras de tejido, la detección de variaciones en el número de copias del genoma, la detección de duplicaciones y deleciones en genes relacionados con la predisposición al cáncer humano y determinación de aneuploidias. Asimismo, MLPA posee un gran potencial para el diagnóstico prenatal

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