SISTEMAS LIGADOS Trx-Glutatión EN PLATHELMINTOS

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1 SISTEMAS LIGADOS Trx-Glutatión EN PLATHELMINTOS
Curso de Biología Parasitaria 2007

2 TPX GPX SOD

3 Tiorredoxina reductasa Tiorredoxina peroxidasa
SISTEMA TIORREDOXINA NADPH NADP+ Tiorredoxina reductasa Tiorredoxina red ox Tiorredoxina peroxidasa Blancos SISTEMA GLUTATIÓN NADPH NADP+ Glutatión reductasa Glutarredoxina red ox Blancos Glutatión peroxidasa

4 Tiorredoxina glutatión reductasa Tiorredoxina peroxidasa
NADPH NADP+ Blancos Tiorredoxina peroxidasa dominio TR Grx

5 ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR
CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG GR CVNVGC FAD NADPH región interfase Grx CPYC GSH TGR CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG CPYC GSH dominio Grx dominio TR

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7 OBTENCIÓN Y ANÁLISIS UN ADNc DE LA TR
DE F. hepatica TCTGTATATTAGTGCATGTCATCTAAAATGGCTCCAATTCCCGATGATACTTCTTCGTGG GCTAAAACGGCCGTATTTGACTTTGTGGTCCCGACGCCCCAGGATACTACACGGGGTTTG GGCTATCGAACTCAGCTTCGCAGCATTAACGTAGAGTATGTTAATGCTTTTGCTGAGGTG GTCGATCCGCATACAATAAAATACACGAAGAAAAACAAGGAAACCGGCACCGTGACCGCA TCCGTAGCGATGAAGGCTGGTGCAACCAAGGCTGATTTCGACCGTACCATAGGGATTCAC CCCACTTGTTTTGAGGGGTTTACTACAATGCACGTGACAAAAGACTCGGGCGCCAGCGCT AAGGTGACCGCTTGCTGAGGTTAATTCCCTGCTGGAGGTTTTCAGTCGGTTATGTTTATC CGTTCACTTTCCAACCAATCCGTGTTTTGTGAAAAGACCCTGAGCTTGGTAAATCCTATC CCGTCCCGGGAGCCAAGTTGTAGGGGATGCCCGCATGGGCCAAACGAACGGCAGCCCCCC CCCCCCCCCTTCTTTGATTACGAAATCTCTCATTTAACATGTTGTGCAGTCTTTATGTCT TTCTCCGAAAAAAAAAAAAAA 60 480 780 1800 1860 2040 2100 2160 2301 720 1740

8 EL ELEMENTO SECIS lazo 3 nt tallo superior 5 pb bucle de adenosinas
G - C U - A C - G G U A - U A - G G - A A - T 2012 2067 A U C G GUUUUGUAAG A GCCCGCAUGGG tallo superior 5 pb bucle de adenosinas tallo inferior núcleo SECIS

9 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA
Fasciola 1 MAPIPDDTS SmanTGR 1 MPPADGTS EgraTGR 1 MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV Fasciola 9 SWVKKTINSSA V LLFSKS R CPYC RAVKQIFNDDKVNHAVIELD SmanTGR 8 QWLRKTVDSAA ILFSKT T KKVKDVLAEAKIKHATIELD EgraTGR 38 EKLRNKINNAA LVFAKS F KKVMERFNNLKIPFGYLDLD Grx Fasciola 53 KRPDGAKI Q QVLSQISGISTV P QVFVRGEFV G DSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTY DYDL SmanTGR 52 QLSNGSAI KCLASFSKIETV QMFVRGKFI DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKY EgraTGR 82 LKKNGSDY KMLQEITGRTTV QVFFRGEFI GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKY DYD M SmanTGR 111 IV IGGGSGGL AAG KEAA KY G A K TAV LD Y V E P T I GT WGLGGT CVNVGC IPKKLMHQA L EgraTGR 140 VI ALA KE S KS VAL LDFV M Fasciola 112 VV AS RF TAVF DFV QD TR GLGGT sitio de unión al FAD centro redox Fasciola 292 V GASYVALECAGFLTRFG F D T TVMV R SI L GFDQ Q MA DMIGEYMKEH G KF VRSCV P SmanTGR 291 VI GASYVALECAGFLASLG DVTVMV EKVGDYMENH AKLCV EgraTGR 318 C GASYVSLECAGFLSSIG GLISDYIAKY VRPCV sitio de unión al NADPH Fasciola 584 TK D -ASAKVTA C U G SmanTGR K -VSPIVS GC EgraTGR 610 S SG -ASATVT selenocisteína

10 PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA
66 kDa

11 ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR
NADPH + NADP+ DTNB 2 TNB (actividad TR) NADPH NADP+ TGR red ox Tiorredoxina Insulina GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ (actividad GR) ESSE + GSH GSSE + ESH (reacción espontánea) GSSE + GSH GSSG + ESH (actividad Grx)

12 LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD TR
LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD TR ox NADPH NADP+ Thioredoxin reductase (TR) Thioredoxin Targets red NADPH red red red red Glutathione reductase Glutathione Glutaredoxin Targets NADP+ ox ox ox ox

13 LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD GR
NADPH red red Thioredoxin reductase (TR) Thioredoxin Targets NADP+ ox ox ox NADPH red red red red Glutathione reductase Glutathione targets Glutaredoxin NADP+ ox ox ox ox LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD GRX

14 El dominio Grx recibe electrones de dominios TR y
también podría recibir del sistema glutatión ox NADPH NADP+ Thioredoxin reductase (TR) Thioredoxin Targets red red red red red NADPH Glutathione reductase Glutathione Targets Glutaredoxin NADP+ ox ox ox ox

15 Tiorredoxina glutatión reductasa Tiorredoxina peroxidasa
La fusión de dominios hace posible la transferencia de electrones a blancos de ambos sistemas Tiorredoxina glutatión reductasa Tiorredoxina red ox NADPH NADP+ Blancos Tiorredoxina peroxidasa dominio TR Grx

16 A partir del gen de la TGR se producen dos isoformas de ARNm por empalme alternativo en trans
1 2 TR Grx SL región codificante

17 Las isoformas de ARNm codifican para variantes
mit MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAE.. cit MAPIGGSAE.. Las isoformas de ARNm codifican para variantes citosólica y mitocondrial ¿Hay TGR en los compartimientos mitocondrial y citosólico? Mic Mit Cit Nuc Tot 66 kDa

18 Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR
Entonces... Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?

19 En otros plathelmintos:
In Taenia crassiceps: Tracing GR and TR activities resulted in purification of TGR (Rendon et al. 2004) In Schistosoma mansoni: Auranofin inhibits both TR and GR activities in crude extracts (Alger and Williams, 2003)

20 Datamining transcriptomes could provide some answers
October 2003: Schistosoma transcriptomes released . Schistosoma mansoni ( ESTs, covering 90-95% of the gene complement) . Schistosoma japonicum ( ESTs) . Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis ( ESTs–Oct 2004)

21 S. mansoni S. japonicum cTGR 38* 18* mtTGR 4 2 GR TR cGrx mtGrx 8*
TR cGrx mtGrx 8* cTrx1 6 26 cTrx2 1 mtTrx 15 3 cTPx1 12 29 cTPx2 30 20 mtTPx 16 10 cGPx 39 secGPx

22 Similar results in E. granulosus and E. multilocularis
. absence of GR and TR . presence of cytosolic and mitochondrial Trx and TPx En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR

23 ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica
semana 0 - 100 μg FhTGR - PBS 1º inmunización semana 4 - 100 μg FhTGR - PBS 2º inmunización semana 6 Desafío - 50 metacercarias semana 18 Sacrificio Nº de Parásitos promedio ± DS parásitos/animal Grupo FhTGR 0,3 ± 0,8 2; 0; 0; 0; 0; 0 Grupo Control 9 ± 1,8 10; 12; 8; 8; 7; 9

24 Schistosoma mansoni Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito. Auranofin: inhibidor de la TGR. En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente. Además, tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásiros encontrados.