Espectrometría de Masa

Presentación del tema: "Espectrometría de Masa"— Transcripción de la presentación:

1 Espectrometría de Masa
Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 8 de mayo de 2014

2 Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002. Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3

3 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS
Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

4 Espectrometría de masa
1- Generalidades

5 separación y determinación de la relación masa/carga de
Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

6 emisión de energía radiante)
Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

7 Espectrometría de masa de Biomoléculas
Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos  Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material

8 Espectrometría de masa de Proteínas
Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional

9 Gel 2D de hígado humano

10 z siempre es un integral positivo
Masa (definiciones) Se determina m/z q = ±ze , e = x coulomb z siempre es un integral positivo

11 Masa Todas las moléculas tienen una composición química única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones) C 6 12.011 12 C 13 C 14 C 6 6 6

12 Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 98.90 13C 1.10 14N 99.634 15N 0.366 16O 99.762 17O 0.038 18O 0.200 31P 100.00 32S 95.02 33S 0.75 34S 4.21 36S 0.02 79Br 50.69 81Br 49.31 Carlos Cerveñansky

13 Masa La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1% Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes

14 Masa Ejemplo: 12C (98.9%) y 13C (1.1%) En Buckminsterfullereno (C60)
La probabilidad que todos los átomos sean 12C: P = (0.989)60 = 0.515

15 Masa

16 Masa

17 Masa: definiciones Masa molecular se mide en unidades de masa atómica unificadas (u) u = m(12C) /12 = × kg (u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora arcaico) Peso atómico: promedio por composición isotópica → Peso molecular Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero Masa más abundante Masa promedio

18 Masa: definiciones Carlos Cerveñansky

19 Masa: definiciones

20 Determinación del número de cargas (z)
520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 524.3 525.3 526.2 Una sola carga: Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu m/z

21 Determinación del número de cargas (z)
258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 262.6 263.1 263.6 Dos cargas: Delta = 0.5 amu Delta = 0.5 amu Delta = 0.5 amu m/z

22 Espectrometría de masa de proteínas
37 kDa 37136 amu

23 Los Iones son importantes
Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M+H]+ o [M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

24 M(péptido) = 1162 Da Espectrometría de masa Modo positivo
Modo negativo m = -1

25 Espectrómetro de masa Espectrometría de masa Muestra TOF MALDI
Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Orbitrap Sector Magnético MALDI ESI Alto Vacío

26 ¿Cómo volatilizar una proteína?
Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

27 Espectrómetros de masa
Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS: ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance Orbitrap: ESI-orbitrap

28 Espectrometría de masa
2- MALDI-TOF

29 Ionización por MALDI: Espectrometría de masa
(Matrix assisted Laser desorption/ionization) (Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:

30 Ionización por MALDI: Espectrometría de masa
La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

31 Espectrometría de masa
MALDI-TOF Matriz: acidos aromaticos

32 Espectrometría de masa
4HCCA DHBA SA

33 t  (m/z)1/2 MALDI-TOF Espectrometría de masa
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

34 MALDI-TOF Ek = zeEs E + - Espectrometría de masa + + D s Detector
Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. E + + s D Detector Fuente

35 MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Fig. Separación por TOF + + + +
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Ek = zeEs = ½mv2  v = (2zeEs/m)½ E Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente

36 MALDI-TOF v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2
Espectrometría de masa MALDI-TOF Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma Ek, v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

37 MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Fig. Separación por TOF + + + +
Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

38 Espectrometría de masa
Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky

39 Espectrometría de masa
Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t Carlos Cerveñansky

40 MALDI-TOF Espectrometría de masa
Generalmente se observa la especie monocargada (M+H)+

41 MALDI-TOF Espectrometría de masa Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM

42 MALDI-TOF Espectrometría de masa
Se pueden estudiar masas en un amplio rango

43 Resolución en MALDI-TOF
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Carlos Cerveñansky

44 Espectrometría de masa
3- ESI-MS

45 ESI Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization N2
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray) N2

46 ESI Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization N2
Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador N2

47 ESI-Q Espectrometría de masa
Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas

48 ESI-Q Espectrometría de masa
Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

49 Espectrometría de masa
Trampa de iones Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”.

50 ESI-MS Espectrometría de masa
La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones m/z = (M+n)/n Donde n es el número de protones (masa = u, ~ 1)

51 ESI y carga [M+2H]2 + Substance P [M+H] + 674.7 1347.7 685.7 600.4
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 Da/e 100 % 674.7 666.1 600.4 462.8 685.7 693.6 1347.7 [M+2H]2 + [M+H] +

52 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

53 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

54 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1)  n = (x2-1)/(x1-x2) n = ( ) / 72.1 = 15 M = ( x 15) -15 = 17328

55 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo

56 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM
Alto PM

57 Espectrometría de masa
ESI-MS Resolución de varias especies

58 Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

59 Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ion
Pocas, en general 1 Muchas Rango de m/z 50000 3000 Rango de masas 70.000 Interacciones no covalentes No Si MS/MS limitado, PSD Si, CID Acoplar LC Tolerancia a contaminantes

60 Conclusión Espectrometría de masa
Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas

61 Continuará…

62 Seroalbúmina humana +45 +44 +47 +46 +49 +48 +51 +50 +52 +54 +53 +56
+55 Lucía Turell

63 Seroalbúmina humana Lucía Turell