DEFENSAS ANTIOXIDANTES Curso de Biología Parasitaria

Presentación del tema: "DEFENSAS ANTIOXIDANTES Curso de Biología Parasitaria"— Transcripción de la presentación:

1 DEFENSAS ANTIOXIDANTES Curso de Biología Parasitaria
EN PLATHELMINTOS Curso de Biología Parasitaria 2013

2 PLATHELMINTOS - Organismos multicelulares - Ciclos de vida complejos:
- Hábitat variados: - intestino - vasos sanguíneos - órganos linfáticos - varios - Ciclos de vida complejos: - varios estadios de desarrollo - migración tisular

3 PREVALENCIA GLOBAL DE INFECCIÓN POR
HELMINTOS HUMANOS Parásito Estimación Helmintos intestinales 1/3 población mundial Esquistosomas millones Parásitos filariales >150 millones

4 DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN

5 ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y DEL NITRÓGENO

6 BLANCOS DE LAS EROs DAÑO CELULAR LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS
Daños en el DNA Ribosilación de poly ADP Alteración de la expresión genética Ruptura de ATP y NAD(P)(H) Bases de schiff AGEs (Advanced glycation end products) Lipoperoxidación Daños en las membranas Oxidación de grupos tioles Formación de grupos carbonilos Daños a los sistemas transportadores ionicos Inestabilidad para mantener gradientes iónicos normales Activación/Desactivación de varios sistemas enzimáticos DAÑO CELULAR

7 ESTRÉS DAÑO OXIDATIVO ALTAS CONCENTRACIONES DE EROs
 Si los EROs no son neutralizados o sus efectos reparados puede producirse la muerte del organismo  Por lo tanto todos los organismos aeróbicos han desarrollado sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para prevenir o reparar el daño oxidativo.

8 MECANISMOS ENZIMÁTICOS
● SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) ● CATALASA ● GLUTATIÓN-S-TRANSFERASA (GST) ● SISTEMA GLUTATIÓN NADPH NADP+ Glutatión reductasa Glutarredoxina red ox Blancos Glutatión peroxidasa

9 MECANISMOS ENZIMÁTICOS
● SISTEMA TIORREDOXINA NADPH NADP+ Tiorredoxina reductasa Tiorredoxina red ox Tiorredoxina peroxidasa Blancos

10 DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN

11 ESTUDIOS DE RESISTENCIA AL ATAQUE OXIDATIVO
Nare et al. Experimental parasitology (1990) 70: ● El estadio adulto de S. mansoni es más resistentes al ataque oxidativo generado in vitro.

12 NIVELES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
Mei and LoVerde. Experimental Parasitology (1997) 86:69-78. Nare et al., Experimental parasitology, 70: ● La mayor resistencia del estadio adulto al ataque oxidativo se correlaciona con niveles altos de enzimas antioxidantes.

13 LOCALIZACIÓN DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
● Se inmunolocalizaron en el tegumento y en el aparatato digestivo Mei and LoVerde. Experimental Parasitology (1997) 86:69-78.

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15 ESTUDIOS REALIZADOS CON F. hepatica
Piedrafita et al. Parasite Immunology (2000), 22:  Experimentos realizados con juveniles de F. hepatica incubados en conjunto con schistosómulas vuelven resistentes a estas últimas frente al ataque oxidativo generado

16 LOS PARÁSITOS ESTÁN MUY BIEN ADAPTADOS
AL ESTRÉS OXIDATIVO - alta expresión de enzimas antioxidantes - alta concentración de estas enzimas en la interfase huésped-parásito: - Productos de excreción/secreciones - Superficie de los parásitos

17 ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS DIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOS
- (CuZn)SOD: formas citosólica y secretadas MnSOD GPx Grx - GST - Sistema Tiorredoxina

18 SCHISTOSOMA MANSONI A. Anti-GST26 tratados con GFP dsRNA.
50uM H2O2 A. Anti-GST26 tratados con GFP dsRNA. B. Anti-GST26 tratados GST26 dsRNA. C. Anti-Prx1/2 tratados con GFP dsRNA. D. Anti-Prx1/2 tratados con Prx1/2 dsRNA Mourao et at. PLOS Neglected Tropical Diseases (2009), 3:1-9.

19 CONCLUSIONES - Hábitat parasitado
● Los niveles de enzimas antioxidantes en plathelmintos se correlacionan positivamente con la capacidad de supervivencia frente a los EROs generados por el huésped. ● Los niveles de enzimas antioxidantes son regulados a lo largo del ciclo de desarrollo del parásito y se encuentran influenciados por: - Hábitat parasitado - Metabolismo energético en los diferentes estadios - Presión inmunológica ● Las distintas clases de helmintos presentan diferentes tipos y niveles de expresión enzimática. ● Las enzimas antioxidantes prometen ser buenos blancos para vacunas mediante: - Inmunización con enzimas purificadas - Diseño de drogas que inhiban selectivamente estas enzimas

20 SISTEMAS LIGADOS Trx-GSH EN PLATHELMINTOS

21 TPX GPX SOD

22 SISTEMA TIORREDOXINA SISTEMA GLUTATIÓN Tiorredoxina reductasa
NADPH NADP+ Tiorredoxina reductasa Tiorredoxina red ox Tiorredoxina peroxidasa Blancos SISTEMA GLUTATIÓN NADPH NADP+ Glutatión reductasa Glutarredoxina red ox Blancos Glutatión peroxidasa

23 ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR
CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG GR CVNVGC FAD NADPH región interfase Grx CPYC GSH CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG TGR CPYC GSH dominio Grx dominio TR

24 PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA
66 kDa 10 mM GSH PM 45 kDa 36 kDa 29 kDa 24 kDa 66 kDa PM TR

25 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA
Fasciola 1 MAPIPDDTS SmanTGR 1 MPPADGTS EgraTGR 1 MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV Fasciola 9 SWVKKTINSSA V LLFSKS R CPYC RAVKQIFNDDKVNHAVIELD SmanTGR 8 QWLRKTVDSAA ILFSKT T KKVKDVLAEAKIKHATIELD EgraTGR 38 EKLRNKINNAA LVFAKS F KKVMERFNNLKIPFGYLDLD Grx Fasciola 53 KRPDGAKI Q QVLSQISGISTV P QVFVRGEFV G DSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTY DYDL SmanTGR 52 QLSNGSAI KCLASFSKIETV QMFVRGKFI DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKY EgraTGR 82 LKKNGSDY KMLQEITGRTTV QVFFRGEFI GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKY DYD M SmanTGR 111 IV IGGGSGGL AAG KEAA KY G A K TAV LD Y V E P T I GT WGLGGT CVNVGC IPKKLMHQA L EgraTGR 140 VI ALA KE S KS VAL LDFV M Fasciola 112 VV AS RF TAVF DFV QD TR GLGGT sitio de unión al FAD centro redox Fasciola 292 V GASYVALECAGFLTRFG F D T TVMV R SI L GFDQ Q MA DMIGEYMKEH G KF VRSCV P SmanTGR 291 VI GASYVALECAGFLASLG DVTVMV EKVGDYMENH AKLCV EgraTGR 318 C GASYVSLECAGFLSSIG GLISDYIAKY VRPCV sitio de unión al NADPH Fasciola 584 TK D -ASAKVTA C U G SmanTGR K -VSPIVS GC EgraTGR 610 S SG -ASATVT selenocisteína

26 TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA
NADPH NADP+ Blancos Tiorredoxina peroxidasa dominio TR Grx

27 ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR
- La enzima purificada posee actividad TR, GR y Grx - Todas estas actividades son inhibidas con sales de oro La fusión de dominios codificada en el gen de la TGR hace posible que la enzima sea capaz de transferir electrones a los blancos de ambos sistemas Tiorredoxina glutatión reductasa Tiorredoxina red ox NADPH NADP+ Blancos Tiorredoxina peroxidasa dominio TR Grx

28 ¿Hay TGR en los compartimientos mitocondrial y citosólico?
Mic Mit Cit Nuc Tot 66 kDa

29 Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR
Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?

30 EN OTROS PLATHELMINTOS
Taenia crassiceps: Seguimiento de una actividad GR y TR resultaron en la purificación de una TGR (Rendon et al. 2004) Schistosoma mansoni: Auranofin inhibe las actividades GR y TR en extractos de parásitos (Alger and Williams, 2003)

31 S. mansoni S. Japonicum cTGR 38* 18* mtTGR 4 2 GR TR cGrx mtGrx 8*
TR cGrx mtGrx 8* cTrx1 6 26 cTrx2 1 mtTrx 15 3 cTPx1 12 29 cTPx2 30 20 mtTPx 16 10 cGPx 39 secGPx

32 - Resultados similares se encontraron en E. granulosus y E
- Resultados similares se encontraron en E. granulosus y E. multilocularis . Ausencia de GR y TR . Presencia de Trx y TPx mitocondrial y citosolica En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR

33 ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica
semana 0 semana 4 semana 6 Desafío semana 18 Sacrificio - 100 μg FhTGR - PBS 1º inmunización - 100 μg FhTGR - PBS 2º inmunización - 50 metacercarias

34 Schistosoma mansoni Auranofin: En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente. Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:

35 Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito.
Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:

36 Tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásitos encontrados. Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:

37 Echinococcus granulosus
A- Control B- 12h C- 30h Bonilla et al. The journal of biological chemistry, (2008) 283:

38 Fasciola hepatica NEJ de F. hepatica incubados con 20 mM de diferentes drogas inhibidoras de TGR durante 48 h. A. 2 (oxadiazole N-oxide), B. 1(oxadiazole N-oxide), C. 4 (oxadiazole N-oxide), D. 61(quinoxaline), E. 50 (thiadiazole), F. control. Ross et al. Plos One (2012) 7:1-12.