Espectrometría de Masa

Presentación del tema: "Espectrometría de Masa"— Transcripción de la presentación:

1 Espectrometría de Masa
Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 7 de mayo de 2009

2 Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

3 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS
Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

4 Espectrometría de masa
1- Generalidades

5 separación y determinación de la relación masa/carga de
Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

6 emisión de energía radiante)
Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

7 Espectrometría de masa de Biomoléculas
Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos  Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material

8 Espectrometría de masa de Proteínas
Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional

9 Gel 2D de hígado humano

10 Espectrometría de masa
cyt C ~ Da

11 Espectrometría de masa biológica
Lisozima

12 PM(péptido) = 1162 Da Espectrometría de masa Modo positivo
Modo negativo m = -1

13 Los Iones son importantes
Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M+H]+ o [M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

14 Espectrómetro de masa Espectrometría de masa Muestra MALDI TOF ESI
Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector MALDI ESI TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector Magnético Alto Vacío

15 ¿Cómo volatilizar una proteína?
Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

16 Espectrómetros de masa
Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap ESI-FTICR: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

17 Espectrometría de masa
2- MALDI-TOF

18 Ionización por MALDI: Espectrometría de masa
(Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

19 Espectrometría de masa
MALDI-TOF Matriz

20 Desorción/Ionización por Laser
Espectrometría de masa MALDI Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz

21 t  (m/z)1/2 MALDI-TOF Espectrometría de masa
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

22 MALDI-TOF Ek = zeEs t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2
Espectrometría de masa MALDI-TOF Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek, ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

23 MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Sin E, iones a la deriva
Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

24 Espectrometría de masa
Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky

25 Espectrometría de masa
Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky

26 Espectrometría de masa
MALDI-TOF

27 Espectrometría de masa
MALDI-TOF Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF

28 Espectrometría de masa
MALDI-TOF

29 Resolución en MALDI-TOF
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Carlos Cerveñansky

30 Los Isótopos son importantes
Espectrometría de masa Los Isótopos son importantes Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu), se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu 1 amu = 1 dalton = x g Abundancia isotópica: 12C % 13C %

31 Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 98.90 13C 1.10 14N 99.634 15N 0.366 16O 99.762 17O 0.038 18O 0.200 31P 100.00 32S 95.02 33S 0.75 34S 4.21 36S 0.02 79Br 50.69 81Br 49.31 Carlos Cerveñansky

32 Carlos Cerveñansky

33 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.
100 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z) 2093 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % Intensity Voyager Spec #1=>MC[BP = , 12005] 2xC13 C12 C13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= FWHM) Carlos Cerveñansky

34 Espectrometría de masa
MALDI-TOF

35 Espectrometría de masa
3- ESI-MS

36 ESI-Q Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization - Quadrupole
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo

37 Espectrometría de masa
ESI N2

38 Espectrometría de masa
ESI

39 ESI-Q Espectrometría de masa
Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

40 Espectrometría de masa
ESI-Q

41 Espectrometría de masa
ESI-Q

42 Espectrometría de masa
ESI-Q

43 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

44 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

45 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1)  n = (x2-1)/(x1-x2) n = ( ) / 72.1 = 15 M = ( x 15) -15 = 17328

46 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo

47 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM
Alto PM

48 Espectrometría de masa
ESI-MS

49 Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

50 Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ion
Pocas, en general 1 Muchas Rango de m/z 50000 3000 Rango de masas 70.000 Interacciones no covalentes No Si MS/MS limitado, PSD Si, CID Acoplar LC Tolerancia a contaminantes

51 Identificación de proteínas
Peptide mass fingerprinting

52 Identificación de proteínas

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55 Espectrometría en Tándem: Secuenciación de péptidos
Espectrometría de masa MS/MS Espectrometría en Tándem: Secuenciación de péptidos

56 MS/MS: Espectrometría en Tándem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tándem Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos” mp+  md+ + mn0 Identificación de moléculas Secuenciación de péptidos “al vuelo” Modificaciones posttraduccionales

57 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-Q Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 y Q3 separan iones moleculares, mientras Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten CID: Collision Induced Dissociation MALDI-TOF Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay

58 Secuenciación peptídica
MS/MS Secuenciación peptídica Mezcla de péptidos MS/MS + 1 péptido seleccionado para MS/MS Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Espectro MS Carlos Cerveñansky

59 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Fragmentación peptídica

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62 By calculating the molecular weight difference between ions of the same type the sequence can be determined. The SEQUEST software, developed in the Yates laboratory, uses the fragmentation information of a tandem mass spectrum to search through the complete protein database of Sacchromyces cerevisiae to identify the sequence which best fits the fragmentation pattern. SEQUEST Performs sequencing and identification by matching unknown MS/MS spectra to sequence in a database Finds all peptides that matches the input masses. Calculates a preliminary score based upon matching ion intensities of predicted frament ions to peaks in the experimental spectrum. Calculates final scores by performing cross correlations of theoretical spectra of the top N preliminary scoring peptides against the input spectrum. Carlos Cerveñansky