Objetivo: Transformar genéticamente a E

Presentación del tema: "Objetivo: Transformar genéticamente a E"— Transcripción de la presentación:

1 Objetivo: Transformar genéticamente a E
Objetivo: Transformar genéticamente a E. coli a través de la inserción de un plásmido con el fin de que adquiera resistencia a antibiótico codificada en dicho plásmido.

2 TRANSFORMACIÓN

3 Fred Griffith 1928, estudió Streptococcus pneumoniae
Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células S “principio transformante”

4 El Principio transformante es DNA!

5 TRANSFORMACIÓN Puede ser:
CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENO Puede ser: NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso) ARTIFICIAL (INDUCIDA)

6 Algunas hipótesis, que no son excluyentes…..
TRANSFORMACIÓN ¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformación Algunas hipótesis, que no son excluyentes….. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos) II. Para la reparación de DNA III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

7 Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C
Desarrollo de un estado competente ¿Qué es una célula competente? Estado fisiológico inducible Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural: Limitación en los nutrientes Mitomicina C Alta densidad celular Temperatura, pH La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia Velocidad de transferencia: nucleótidos/segundo a 30°C

8 TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL
El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generación de organismos transgénicos

9 PLÁSMIDOS

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11 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA
Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA DH5α XL Blue

12 En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria?
1. Tratamiento químico 2. Electroporación

13 Preparar células competentes de E. coli
A= de 0.2 a 0.4 a 600 nm

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15 LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO

16 A nivel molecular

17 Electroporación

18 Utilizaremos el plásmido pBluescript II KS
Sitio múltiple de restricción Gen que confiere resistencia a ampicilina Origen de replicación Inserto de 1100 bp

19 Monitoreo de la transformación

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21 Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:
La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos. La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: Adenilación de grupos hidroxilo. Fosforilación de grupos hidroxilo. Acetilación de grupos amino. ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO: Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina. Gentamicina acetiltransferasa Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Kanamicina acetiltransferasa Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina

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23 TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

24 ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

25 Medio Luiria + KANAMICINA
Células no transformantes Células transformantes Medio Luiria + KANAMICINA

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