Phred / Phrap /Consed Genome/Sequence Assembly

Presentación del tema: "Phred / Phrap /Consed Genome/Sequence Assembly"— Transcripción de la presentación:

1 Phred / Phrap /Consed Genome/Sequence Assembly
Fernán Agüero Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Universidad Nacional de General San Martín 1 Fernán Agüero

2 Qué es phred/phrap/consed?
Phred/Phrap/Consed es un paquete de software utilizado para: Leer cromatogramas (trace files) Asignar valores de calidad a las bases individuales de una secuencia Identificar y enmascarar secuencias correspondientes a vector (plásmido) o secuencias repetitivas Ensamblar secuencias individuales en contigs Visualizar assemblies (contigs) Hacer ‘sequence finishing’ auto dirigido (automatic finishing) 2 Fernán Agüero

3 Por que hay que ensamblar?
Los métodos actuales de secuenciación generan lecturas de pb (límite de resolución de la electroforesis) Para secuenciar un genoma, o cualquier segmento largo de DNA (cromosomas) hay que fragmentarlo (bibliotecas de clones) En la estrategia conocida como ‘shotgun sequencing’ los clones se seleccionan al azar, se obtienen lecturas de los extremos y se ensamblan para obtener la secuencia final 3 Fernán Agüero

4 Phred: a basecaller Genome Res 8 (1998): 175 Genome Res 8 (1998): 186
4 Fernán Agüero

5 Phred is a program that performs several tasks:
Reads trace files – compatible with most file formats: SCF (standard chromatogram format), ABI (373/377/3700), ESD (MegaBACE) and LI-COR. Calls bases – attributes a base for each identified peak with a lower error rate than the standard base calling programs. Assigns quality values to the bases – a “Phred value” based on an error rate estimation calculated for each individual base. Creates output files – base calls and quality values are written to output files. 5 Fernán Agüero

6 Alta calidad, sin ambigüedad
Trace files Alta calidad, sin ambigüedad 6 Fernán Agüero

7 Calidad media, algunas ambigüedades
Trace files Calidad media, algunas ambigüedades 7 Fernán Agüero

8 Trace files Baja calidad
la confianza en la asignación de bases es menor 8 Fernán Agüero

9 q = - 10 x log10 (p) Phred qualities Donde: q = quality value
p = estimated probability error for a base call Ejemplos: q = 20 significa p = 10-2 (1 error cada 100 bases) q = 30 significa p = 10-3 (1 error cada 1000 bases) q = 40 significa p = 10-4 (1 error cada bases) 9 Fernán Agüero

10 Phred: PHD files BEGIN_SEQUENCE 01EBV10201A02.g BEGIN_COMMENT CHROMAT_FILE: EBV10201A02.g ABI_THUMBPRINT: PHRED_VERSION: g CALL_METHOD: phred QUALITY_LEVELS:99 TIME: Thu May 24 00:18: TRACE_ARRAY_MIN_INDEX: 0 TRACE_ARRAY_MAX_INDEX: 12153 TRIM: CHEM: term DYE: big END_COMMENT BEGIN_DNA t 8 5 c 13 17 a 19 26 c 19 32 t a a a g c c t g g g g t g c c t a a t g t g t c g n c t t c t c c c t c g g a g g t a g t c a g c n c n n n n n n n c n END_DNA END_SEQUENCE 10 Fernán Agüero

11 Quality values in FASTA format
Phred: QUAL files Quality values in FASTA format > ABI trimmed 11 Fernán Agüero

12 Phrap: an assembler Phrap ensambla secuencias de DNA provenientes de proyectos de secuenciación al azar (shotgun) Usa la información de calidad provista por phred no hay necesidad de recortar las secuencias Puede usar bibliotecas de secuencias repetitivas (por ej Repbase) o usar datos sobre repeticiones calculadas internamente Mejor calidad de los resultados en presencia de repeticiones La secuencia final (contig) es un mosaico formado por las regiones de mejor calidad de cada secuencia No es un consenso! Puede manejar grandes sets de datos Cientos de miles de secuencias con facilidad 12 Fernán Agüero

13 Consed: a finisher Genome Res 8 (1998): 195 13 Fernán Agüero

14 Consed 14 Fernán Agüero

15 Consed 15 Fernán Agüero

16 Consed 16 Fernán Agüero

17 Consed 17 Fernán Agüero

18 Consed 18 Fernán Agüero

19 Phred / Phrap /Consed pipeline
Input chromatogram files Quality (confidence) values assignment Phred phd files - *.phd Conversion - phd to fasta phd2fasta.pl nucleotide sequences - seqs_fasta quality values - seqs_fasta.screen.qual Vector screening and masking Cross_Match (local alignment program) x vector.seq screened/masked file - seqs_fasta.screen Assembly Phrap assembled contigs - seqs_fasta.screen.contigs assembly file - seqs_fasta.screen.ace# Chromat_dir Assembly viewing/editing Phd_dir Consed Edit_dir Finishing Consed 19 Fernán Agüero

20 Consed: autofinish Finish/finishing
en secuenciación es el proceso de acabado de una secuencia edición manual corrección de errores de ensamblado y/o de secuencia re-secuenciación de clones seleccionados, o de productos de PCR amplificados ad hoc Clonado de regiones difíciles Validación del ensamble! 20 Fernán Agüero

21 Otros paquetes similares
Staden Package staden.sf.net Integrado, como phred/phrap/consed Sólo ensamblado Celera Assembler TIGR Assembler CAP4 (Paracell) Sólo enmascarado de repeticiones/vector RepeatMasker Sólo basecaller Varios: cada secuenciador tiene el suyo propio Applied Biosystems (ABI): KB Basecaller (provee valores de calidad en las ultimas versiones) Pharmacia (MegaBACE): Cimarron Basecaller LifeTrace: Genome Res (2001) 11: 875 21 Fernán Agüero