GK-07.

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1 GK-07

2 > sustancias solubles en agua
DENATURACION de PROTEINAS Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales efecto de > Temperatura > pH > detergente > sustancias solubles en agua

3 Preparación de proteínas
factor atención durante la preparación evitar alta temperatura, dejar en HIELO temperatura congelar-descongelar determinar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado denaturación física no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas efecto de dilución oxidación metales pesados crecimiento de bacterias proteasas mantener conc. > 1mg/ml incluir 0,1 – 1mM DTT en el tampon incluir 1 – 10mM EDTA en el tampon utilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelar incluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO

4 PURIFICACION DE PROTEINAS
necesario para revelar su estructura desarrollo de inhibidores desarrollo de vacunas aislar proteínas recombinantes para vacunas - etc...

5 Vacuna de proteína recombinante
Vacas clonadas y geneticamente modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia) Diseño de drogas Taste receptors

6 Estrategia de purificación de proteínas
selección del tejido homogenización clarificación – precipitación solubilización y PURIFICACIÓN - captura purificación mediana pureza purificación, ultra pureza necesario test para monitorear ej. detección inmunológica o test funcional

7 Max Perutz, hemoglobina
John Kendrew, mioglobina,

8 Cachalote (Physeter catodon)
                                                                                       Cachalote (Physeter catodon) 17,8 kDa

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10 Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,

11 Localización de los átomos

12 Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.

13 Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria)
 FUNCION Para obtener cristales  proteína pura

14 Proteína, Purificación
Fraccionamiento celular Centrifugación Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH Cromatografía exclusión por tamaño Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un “bead”, selectivo, unión proteina-proteina

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16 Fraccionamiento celular

17 SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA
TIPOS DE CENTRÍFUGAS MICRÓFUGA DE BAJA VELOCIDAD DE ALTA VELOCIDAD ULTRACENTRÍFUGA

18 TIPOS DE ROTORES ROTORES FLOTANTES centrífuga baja velocidad
Ultracentrífuga ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES ROTOR VERTICAL

19 Centrifugación diferencial:
ROTORES FLOTANTES Centrifugación diferencial: DESPUÉS PELLET SOBRENADANTE ANTES HOMOGENEIZADO CENTRIFUGACIÓN En gradiente de densidad:

20 Fraccionamiento celular

21 Fraccionamiento celular

22 Fraccionamiento celular

23 Fraccionamiento celular

24 CROMATOGRAFIA por carga: intercambio iónico ej. DEAE (+), CM (-)
por tamaño: exclusión, los grandes primero ej. Sephadex = filtración por gel por especificidad: afinidad entre proteína-proteína ej. anticuerpo

25 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

26 las proteínas con carga negativa pasan de largo
Ej. intercambiador cationico proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa las proteínas con carga negativa pasan de largo

27 Cromatografía de Intercambio Ionico

28 CM-agarosa CARGA NEGATIVA
carboximetil-agarosa

29 DEAE-columna CARGA POSITIVA
Dietilaminoetil

30 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Intercambio iónico - intercambiador cationico (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-) proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna intercambiador aniónico (tiene carga positiva, ej. DEAE+) proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna

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32 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

33 Cromatografía de filtración en gel

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36 Cromatografía de filtración en gel

37 DIALISIS Separación por tamaño eliminación de sal

38 al principio de la diálisis
bolsa de diálisis solución concentrada tampón en equilibrio al principio de la diálisis

39 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

40 Cromatografía de Afinidad

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42 Proteína retenido por interacción con ligando
Elusión por adición de exceso de ligando

43 Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación

44 - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico
ELECTROFORESIS electro-foresis; del griego, estar llevado Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno Las proteínas se separan por - carga eléctrica - tamaño y forma

45 ( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro)
el  -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox ( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro) A2 b-mercaptoetanol HS S S + SH A1 A1 A2 El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol

46 Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH
a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada negativamente

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49 El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el desplegamiento de las mismas SDS SH – La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)

50 única conexión eléctrica vía el gel
CÁTODO Fuente de poder reservorio de tampón superior e inferior única conexión eléctrica vía el gel Electrodo de platinum + ÁNODO electrodo de platinum

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53 SDS-PAGE condiciones denaturantes fraccionamiento por tamaño
comparación con estándar de tamaño molecular

54 Proteína purificada

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56 Determinación de la secuencia de proteínas
ESTRUCTURA PRIMARIA - composición de aa digestión con 5M HCl, análisis HPLC - determinación del aa amino terminal 2,4-dinitrophenyl, DNFB-amino-aa y aa libres - secuenciación de péptido (25-30aa) degradación Edman, del amino-aa sucesivamente

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58 Pero: proteínas > 100 aa
- fragmentar - secuenciar péptidos - ordenar secuencia

59 Punto de ruptura Tratamiento tripsina quimotripsina proteasa V8 bromuro de cianogeno (CNBr) Lys, Arg Phe, Trp, Tyr Asp, Glu Met O H O R2 - C – C – N – C – C – N – C – C – N - R1 H O R3 H cortan el enlace peptídico

60 péptidos secuenciados
Ej. tratamiento péptidos secuenciados Tyr-Lys Glu-Met-Leu-Gly-Arg Pro-Met-Arg Met-Gly-Cys-Lys hidrólisis con tripsina Leu-Gly-Arg-Met Tyr-Lys-Glu-Met Gly-Cys-Lys-Pro-Met + amino acido básico hidrólisis con CNBr SECUENCIA deducida: fragmentos con tripsina Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Cys-Lys-Pro-Met-Arg fragmentos con CNBr

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