M. en C. Montserrat López Coria

Presentación del tema: "M. en C. Montserrat López Coria"— Transcripción de la presentación:

1 M. en C. Montserrat López Coria
Identificación, clonación y caracterización funcional de los transportadores SWEET durante la germinación del maíz. M. en C. Montserrat López Coria

2 Expresión de SWEET en sistemas heterólogos.
Obtener el DNA de la región codificante (clonas). Ligación a un vector. Introducción de secuencia al vector donador Introducción de secuencia al vector de expresión. Transformación de levaduras, protoplastos….

3 PCR ThermoFisher Scientific

4 Fw Oligonucleótidos Rv PCR con una polimerasa de alta fidelidad

5 Polimerasa de alta fidelidad Electroforesis en gel de agarosa 0.7%
No añade cola de PoliA Clontech Electroforesis en gel de agarosa 0.7% ZmSWEET Peso esperado (ORF) 4c 1016 pb 6b 923 pb 11a 1481 pb 14b 1263 pb AtSWEET12 1149 pb Recuperación de DNA

6 Reacción de adenilación para la ligación en el vector pGEM-Teasy
Reactivo Buffer Taq+KCl+MgCl2 10X Taq DNA pol 5U/µL dATP 0.2mM Amplicón PCR MgCl2 1.5mM H2O libre de DNAsas c.b.p 10 µL AAAAAAAA 70°C, 30 minutos Ligación en el vector pGEM-Teasy Plásmido linearizado con extremos T. Vector de alta copia. Promotores fuertes. Región codificante de la enzima beta galactosidasa. Reactivo Rapid ligation Buffer 2X Plásmido pGEM-T Easy (50ng) Amplicón PCR+A-Tail T4 DNA ligasa 3U/ µL H2O libre de DNAsas 4°C, 14 h

7 ¿El inserto está presente en el vector?
Transformación de E. coli cepa DH5α DH5α: Mutación endA1, la cepa tiene endonucleasas inactivas. Mutación recA, reduce la recombinación.

8 Mutación lacZ-ΔM15. Deleción del fragmento N-terminal, haciendo que la función de galactosidasa dependa de la expresión del fragmento lacZ de otra fuente (plásmido).

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10 Células competentes DH5α
Transformación Células competentes DH5α Las células a 4°C en presencia de cationes divalente como Ca2+ prepara las membranas celulares para ser permeables al plásmido. Las células son incubadas en hielo con el ADN y luego se aplica un shock térmico (42 °C por 50 segundos), lo que causa que el ADN entre en la célula.  24h 37°C IPTG X-gal Amp Medio LB

11 Comprobación de la presencia del inserto.
Ensayo de restricción Secuenciación En dos sentidos T7 primer m13/pUC REVERSE Obtención del plásmido Elegir enzimas de restricción con 2 sitios de corte en el plásmido y no en nuestra secuencia Cultivo de una cepa en LB/Amp (ON) Recuperación de plásmido Zippy Plasmid Mini-Prep (Zymmo Research) Cuantificación

12 Alineamiento

13 Tecnología Gateway

14 Carvente-García, 2014

15 Clonación Gateway (1ª reacción de recombinación)
pDNOR221 ZmSWEET4c pDNOR221-ZmSWEET4c

16 AttP AttP

17 Construcción del plásmido
Ensayo de restricción Secuenciación MLUI Std pDNORTM221-ZmSWEET4c 1000 pb 4000 pb Vv

18 Clonación Gateway (2ª reacción)
pDNOR221-ZmSWEET4c pDRF1-Gw pDRF1Gw-ZmSWEET4c

19 Attr Attr

20 Construcción del plásmido Ensayo de restricción
Recuperación del plásmido Transformación de levaduras

21 Crecimiento en medio selectivo Smal-ura
Cepa EBY4000 Crecimiento en medio selectivo Smal-ura Carece de transportadores de sacarosa y glucosa (17 mutaciones!) Capaz de crecer en maltosa. Transformación de levaduras T-mix PEG 3500 Molécula anfipática. CH3COOLi Permeabiliza la pared celular Los cationes monovalentes incrementan la eficiencia de transformación. ssDNA acarreador Satura los sitios de unión de DNA en la pared celular. También modifica la estructura de la pared. DNA plasmídico DNA de interés

22 Localización intracelular
Se hizo la reacción de recombinación con el vector pDNOR221 y el vector pAG426GPD para ver la localización de los SWEET en levaduras silvestres W303.

23 Expresión en protoplastos
bio-protocol.org

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25 Diseño de péptidos para la obtención de anticuerpos
Excluir regiones complejas e inaccesibles como α hélices y β plegadas. La longitud del péptido debe ser entre 10 a 20 aminoácidos. Excluir largas cadenas de residuos hidrofóbicos. Excluir del N-terminal Gln o Asn y del C-terminal Pro y Gly. Excluir más de tres Ser, Pro o Gln. Excluir el motivo Arg-Gly-Asp