Replicación del DNA 2007-2008.

Presentación del tema: "Replicación del DNA 2007-2008."— Transcripción de la presentación:

1 Replicación del DNA

2 1953 artículo en Nature Watson y Crick

3 Doble hélice: estructura del DNA
Estructura molecular de los ácidos nucleicos James Watson y Francis Crick  (1953) Nature, 171, 737-8 Queremos proponer una estructura para la sal del ácido desoxirribonucleico (ADN). Esta estructura posee unas características nuevas que tienen un considerable interés biológico. Pauling y Corey ya propusieron una estructura para el ácido nucleico. Nos ofrecieron amablemente su artículo antes de publicarlo. Su modelo consistía en tres cadenas alternadas que formaban una estructura común, cuyos grupos fosfatos estaban situados cerca del eje de simetría de la estructura y las bases estaban dirigidas hacia el exterior. En nuestra opinión esta estructura es insatisfactoria por dos razones: 1) Nosotros creemos que el material que da los diagramas de rayos X es la sal, no el ácido libre. Sin los átomos de hidrógeno ácidos no está claro cuales son las fuerzas que mantienen unida la estructura, en especial si se considera que los fosfatos negativos, situados cerca del eje, se repelen entre sí. 2) Algunas de las distancias de van der Waals parece que son demasiado cortas. Faser también ha sugerido una estructura de tres cadenas (en prensa). En su modelo los fosfatos están situados hacia el exterior y las bases hacia el interior, unidas entre sí por enlaces de hidrógeno. La estructura descrita de esta forma no queda claramente definida y por esta razón no la comentaremos. Nosotros queremos avanzar una estructura radicalmente distinta para la sal del ácido desoxirribonucleico. Esta estructura posee dos cadenas helicoidales cada una de ellas enrollada alrededor del mismo eje (véase diagrama). Hemos hecho las suposiciones químicas normales, es decir, que cada cadena está formada por grupos fosfato diéster unidos a restos de p-D-desoxirribofuranosa por enlaces 3', 5'. Las dos cadenas (pero no sus bases) están relacionadas por un eje de simetría de 180 ° perpendicular al eje de la estructura. Ambas cadenas son hélices que giran hacia la derecha, pero debido al eje de simetría de 180° las secuencias de los átomos en las dos cadenas van en direcciones opuestas. Cada cadena se parece vagamente al modelo N.° 1 de Furberg; es decir, las bases están en el interior de la hélice y los fosfatos en el exterior. La configuración del azúcar y de los átomos vecinos es parecida a la «configuración estándar» de Furberg, estando el azúcar en posición mas o menos perpendicular a la base a la que está unido. En cada cadena hay un resto cada 3,4 Å en dirección z. Suponemos que existe un ángulo de 36° entre dos restos adyacentes de la misma cadena, de tal manera que la estructura se repite cada 10 restos en cada cadena, es decir, cada 34 Å. Ya que los fosfatos están situados hacia el exterior, son fácilmente accesibles para los cationes. Esta estructura es una estructura abierta, y su contenido en agua es bastante elevado. Si el contenido en agua fuera más bajo esperaríamos que las bases adoptaran una cierta inclinación de modo que sería más compacta. La característica nueva de esta estructura es la forma en que las dos cadenas se mantienen unidas por las bases purínicas y pirimidínicas. Los planos de las bases son perpendiculares al eje de la estructura. Las bases se unen a pares, una base de una cadena establece un enlace de hidrógeno con otra base de la otra cadena, de modo que las dos están situadas una al lado de otra y tienen las mismas coordenadas z. Una de las bases que forman el par debe ser una purina y la otra una pirimidina para que pueda tener lugar el enlace. Los enlaces de hidrógeno se establecen como sigue: la purina de la posición 1 con la pirimidina de la posición 1; la purina de la posición 6 con la pirimidina de la posición 6. Si suponemos que las bases sólo pueden hallarse en la estructura en las formas tautoméricas más plausibles (es decir, en las configuraciones ceto y no en las enólicas) encontramos que sólo pueden enlazarse unos determinados pares de bases. Estos pares son: adenina (purina) con timina (pirimidina) y guanina (purina) con citosina (pirimidina). En otras palabras, si una adenina constituye un miembro de un par, en una de las cadenas, entonces según estas suposiciones el otro miembro debe ser la timina; de igual forma que la guanina y la citosina. La secuencia de bases de una cadena individual no parece estar restringida de ninguna forma. Sin embargo, si sólo pueden establecerse unos pares de bases específicos, se deduce que, dada la secuencia de bases en una cadena, la secuencia en la otra cadena viene automáticamente determinada. Se ha encontrado experimentalmente que en el ácido desoxirribonucleico la relación entre la cantidad de adenina y timina y entre la de guanina y citosina, es siempre muy próxima a la unidad. Probablemente, es imposible construir esta estructura con un azúcar ribosa en lugar de la desoxirribosa, ya que el átomo de oxígeno extra establecería un enlace de van der Waals demasiado cerca. Los datos de rayos X publicados hasta ahora sobre el ácido desoxirribonucleico son insuficientes para poder establecer una comprobación rigurosa de nuestra estructura. Por lo que podemos decir hasta ahora, es más o menos compatible con los datos experimentales, pero debe considerarse como no probada hasta que se pueda verificar con resultados más exactos. Algunos de ellos se dan en las comunicaciones siguientes. Nosotros no conocíamos los detalles de los resultados presentados allí cuando ideamos nuestra estructura, que se basa principalmente, aunque no del todo, en datos experimentales publicados y argumentos estereoquímicos. No se nos escapa el hecho de que el pareo específico que hemos postulado sugiere inmediatamente un posible mecanismo de copia para el material genético. “No escapa a nuestro conocimiento que el apareamiento específico que hemos postulado sugiere inmediatamente un posible mecanismo de copiado del material genético” Watson & Crick

4 Direccionalidad del DNA
Necesitas enumerar los Carbonos! ¿Qué importa esto? nucleótido PO4 Base N 5 CH2 ¡Esto será importante!! O 4 1 ribosa 3 2 OH

5 El eje o esqueleto del DNA
5 PO4 Uniendo el eje del DNA Se refiere a los extremos 3 y 5 del DNA El último Carbono de los extremos base CH2 5 O 4 1 C 3 2 O –O P O Suena trivial, pero… esto es importante!! O base CH2 5 O 4 1 3 2 OH 3

6 Hebras Anti-paralelas
Los nucleótidos en el esqueleto del DNA están unidos por enlaces entre el fosfato de un nucleótido y la pentosa siguiente entre los carbonos 3 y 5 La molécula de DNA tiene “dirección” Hebras complementarias corren en dirección opuesta 5 3 3 5

7 Enlaces en el DNA Hidrógeno 5 3 3 5 Puentes de Enlace covalente
Fosfodiéster Un enlace fosfodiéster es un tipo de enlace covalente que se produce entre un grupo hidroxilo (–OH) en el carbono 3' y un grupo fosfato(H3PO4) en el carbono 5' del nucleotido entrante, formándose así un doble enlace éster. Los enlaces fosfodiéster son esenciales para la vida, pues son los responsables del esqueleto de las hebras de ADN y ARN. También están presentes en los fosfolípidos, moléculas constituyentes de las bicapas lipídicas de todas las membranas celulares. Tanto en el ADN como en el ARN, el enlace fosfodiéster es el vínculo entre el átomo de carbono 3' y el carbono 5' del azúcar ribosa. Los grupos fosfato del enlace fosfodiéster tienen una alta carga negativa 3 5 …¿Enlaces fuertes o débiles? ¿Cómo encajan los enlaces en el mecanismo de copiado del DNA?

8 Pareo de bases en el DNA Purinas Pirimidinas Pareo Adenina (A)
guanina (G) Pirimidinas timina (T) citosina (C) Pareo A : T 2 puentes de H C : G 3 puentes de H

9 Copiando el DNA Replicación del DNA
El pareo de bases permite que cada hebra sirva como un Molde para una nueva hebra Cada Hebra tienen ½ de la hebra molde y ½ DNA nuevo.

10 presentarles al equipo
Replicación del DNA Permítanme presentarles al equipo Un equipo grande de enzimas coordina la Replicación enzimas Más de una docena de enzimas y otras proteínas participan en la replicación del DNA

11 Proteínas de unión a cadena simple
Replicación: 1er paso Apertura del DNA Enzima Helicasa Cataliza el desdoble y apertura de la hélice del DNA Estabilizada por Proteínas de unión a cadena simple(Single strand binding protein) helicasa Proteínas de unión a cadena simple Horquilla de Replicación

12 ¿Dónde está la ENERGÍA para los enlaces?
Replicación: 2do paso Se Construye hebra de DNA hija Se añaden nuevas bases complementarias DNA polimerasa III Pero… Se nos olvida algo! ¿Qué? ¿Dónde está la ENERGÍA para los enlaces? DNA Polimerasa III

13 Energía para la Replicación
¿De dónde viene la energía para formar los enlaces? Venimos con nuestra propia energía Recuerdas al ATP! ¿Hay otras maneras de obtener energía fuera de él? energía Energía ¿hay otros nucleótidos energéticos? ¡Obvio! La energía necesaria para la replicación del ADN proviene de la ruptura de los enlaces entre los fosfatos de los mismos nucleótidos que se unen formando la nueva cadena de ADN. GTP-Transferencia de energía El GTP está implicado en la transferencia de energía en el interior de la célula. Por ejemplo, una molécula de GTP es generada en cada recorrido del ciclo de Krebs. Su energía es equivalente a la de generar una molécula de ATP, de hecho, es rápidamente convertida a éste. Traducción genética Durante la fase de elongación de la traducción, el GTP se utiliza como fuente de energía para la unión de un nuevo complejo aminoácido-ARNt al sitio A del ribosoma. Del mismo modo, el GTP es usado como fuente de energía para la translocación del ribosoma hacia el extremo 3' del ARNm. Realizan la primera simulación realista de la apertura del ADN a alta resolución (mayo de 2010) Los investigadores Modesto Orozco, jefe del grupo de Modelización y bioinformática del IRB Barcelona, Catedrático de Bioquímica de la UB y director del Departamento de Ciencias de la Vida del BSC, y Alberto Pérez, investigador Juan de la Cierva en el BSC, actualmente en la Universidad de California San Francisco (Estados Unidos), publican los resultados en la revista líder mundial en química, Angewandte Chemie. Alberto Pérez explica que "gran parte de las funciones del ADN se dan al separarse sus dos cadenas cuando, por ejemplo, se tiene que replicar durante la división celular o en procesos de reparación. Con este estudio proponemos un mecanismo para este proceso, que a su vez, guiará a nuevos experimentos para su corroboración final". Los investigadores han estudiado un fragmento pequeño de ADN, de 12 pares de bases (el genoma humano tiene unos millones de pares de bases), y han obtenido 10 millones de fotos estructurales que muestran la película de cómo se despliega. En este proceso han revelado dos rutas principales que llevan del estado de su estructura natural plegada a la forma desplegada. "Este proyecto", explica Orozco, "es parte de un objetivo mayor del laboratorio: intentar comprender los cambios que sufre la estructura del ADN según los procesos biológicos que ocurren dentro de la célula, como la expresión y represión de genes o la replicación o transcripción del ADN." y dejamos atrás un nucleótido! TTP CTP ATP GTP GMP ADP AMP TMP CMP Nucleótido modificado

14 Energía para la Replicación
Los nucleótidos llegan como nucleósidos Bases de DNA con P–P–P P-P-P = energía para enlaces Las bases de DNA arriban con su propia fuente de energía para formar enlaces Enlaces catalizados por enzima: DNA polymerasa III ATP GTP TTP CTP

15 Replicación Añadiendo bases
5 3 Replicación energía DNA Polimerasa III Añadiendo bases Puede sólo enlazar nucleótidos al extremo 3 de una hebra de DNA en crecimiento Necesita un nucleótido de “inicio” para unirse a la hebra en crecimiento en sentido 53 energía DNA Polimerasa III DNA Polimerasa III energía DNA Polimerasa III The energy rules the process. energía La energía regula el proceso 3 5

16 Se necesitan Base Ns “primer” sin energía para enlace
5 3 5 3 Se necesitan Base Ns “primer” energy sin energía para enlace  energía energía energía energy ligasa energía energía 3 5 3 5

17 Hebra Adelantada y retrasada
Okazaki Hebra Adelantada y retrasada Límites de la DNA polimerasa III Sólo puede añadir nucleótidos en un grupo 3-OH de una hebra de DNA existente.  5 Fragmentos de Okazaki 5 5 3 5 3 5 3 ligasa Hebra retrasada 3 Horquilla de Replicación 3 5 Hebra adelantada  La ADN polimerasa III sólo puede añadir un nucleótido en un grupo 3'-OH que ya existe. Por esta razón la ADN pol necesita un cebador al grupo 3' -OH del cual puede añadir el primer nucleótido. 3 5 Hebra retrasada Fragmentos de Okazaki Unidos por ligasa Enzima “soldadora de puntos” 3 DNA polimerasa III Hebra adelantada Síntesis continua

18 Horquilla y burbujas de Replicación
5 3 3 5 DNA Polimerasa III Hebra adelantada 5 3 5 3 5 5 3 Hebra retrasada 5 3 5 3 5 3 5 Hebra retrasada Hebra adelantada Horquilla de replicación creciente Horquilla de replicación creciente 5 Hebra adelantada Hebra retrasada 3 5 5 5

19 Inicio de síntesis de DNA : RNA primers
Límites de la DNA Polimerasa III Puede sólo construir sobre el extremo 3 de una hebra de DNA existente. 5 5 3 5 3 5 3 3 Horquilla de replicación creciente 5 3 primasa 5 DNA Polimerasa III RNA RNA primer Formado por la primasa Sirve como cebador (iniciador) de la secuencia para la DNA Polimerasa III 3

20 Reemplazo de los RNA primers con DNA
DNA Polimerasa I remueve secciones del RNA primer y los reemplaza con nucleótidos de DNA. DNA Polimerasa I 5 3 ligasa 3 5 Horquilla de replicación creciente 3 5 RNA 5 Pero la DNA Polimerasa I todavía puede sólo construir sobre el extremo 3 de una hebra de DNA existente. 3

21 ¡Houston, tenemos un problema! Horquilla de replicación
Erosión del cromosoma Todas las DNA Polimerasas pueden sólo añadir en el extremo 3 de una hebra de DNA existente. DNA Polimerasa I 5 3 3 5 Horquilla de replicación creciente 3 DNA Polimerasa III 5 RNA 5 Pérdida de bases en el extremo 5 en cada Replicación Los cromosomas se acortan con cada Replicación ¿Limita el N° de divisiones celulares? 3

22 Horquilla de replicación
Telómeros Secuencias no codificantes en el extremo de los cromosomas = Capucha protectora Limita a ~50 divisiones celulares 5 3 3 5 Horquilla de replicación creciente 3 telomerasa 5 Debido a la naturaleza del proceso de la replicación de ADN las puntas (telómeros) de nuestrascromosomas se vuelven más cortas después de cada replicación. El acortamiento de las cromosomas sirve para limitar el número de tiempos que caulquier célula pueda pasar por división. Cuando los telómeros se acortan a una longitud crítica la célula es incapaz de replicar su ADN sin perder material genético vital. Las células normales que hayan a este punto entra en envejecimiento celular, o arresto de crecimiento, después de la cual ya no pueden dividirse más. Las células cancerosas tienen la habilidad de replicarse in llegar a un estado de envejecimiento. En varios cánceres la habilidad de dividirse sin límite es logrado por la producción de una enzima llamadatelomerasa. La telomerasa mantiene las puntas de las cromosomas para que no se acorten. La telomerasa es una proteína normal que está presente en las células durante el desarrollo del feto. En la mayoría de células de un adulto humano, la telomerasa no está presente ya que el gen para la enzima no está siendo expresada (transcrita y traducida). Sin embargo, en algunas células cancerosas esta tarea necesaria es llevada a cabo por la reactivación del gen que codifica la telomerasa. 5 Telomerasa enzima que actúa en los extremos: Telómeros Puede añadir bases de DNA en el extremo 5 Diferentes niveles de actividad en differentes células Alta en células madres y cancerosas -- ¿Por qué? TTAAGGG TTAAGGG TTAAGGG 3

23 Horquilla de replicación creciente
DNA Polimerasa III Hebra retrasada DNA Polimerasa I 3’ primasa Fragmentosde Okazaki 5’ 5’ ligasa SSB 3’ 5’ 3’ helicasa DNA Polimerasa III 5’ Hebra adelantada 3’ Dirección de Replicación SSB = single-strand binding proteins= Prot. de unión a cadenas simples

24 DNA Polimerasa III enzima
Roger Kornberg 2006 (DPII) DNA Polimerasas DNA Polimerasa III 1000 bases/segundos! principal Constructor de DNA DNA Polimerasa I 20 bases/segundos edita, repara y remueve primers Arthur Kornberg 1959 DNA Polimerasa III enzima En 1958, Arthur Kornberg, a partir de 60 kg de Escherichia coli, logró obtener miligramos de una enzima que él denominó ADN polimerasa; ésta era capaz de sintetizar una nueva cadena de ADN a partir de una cadena existente y empleando nucleótidos trifosfato. Posteriormente, se demostró que la nueva molécula sintetizada en esas condiciones era biológicamente activa, es decir, conservaba en su totalidad la información genética. La enzima ADN polimerasa parecía ser la responsable de la replicación del ADN que años atrás había postulado James Watson y Francis Crick. Roger Kornberg Fue galardonado con el Premio Nobel de Química 2006, por dilucidar la estructura tridimensional del complejo enzimático ARN polimerasa II de la levadura;1 este enzima es clave en el proceso de transcripción genética en las células eucarióticas, proceso mediante el cual se copia la información del ADN al ARN. Es hijo de Arthur Kornberg, quien ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 por su investigación sobre la manera en que la información genética era transferida de una a otra molécula de ADN. Es uno de los pocos casos de padre e hijo que reciben la distinción de un Nobel.

25 Edición y corrección de DNA
1000 bases/segundo = ¡Un lote de errores “tipográficos”! DNA Polimerasa I Corrige errores Repara bases malpareadas Remueve bases anormales repara daños a través de la toda tu hermosa vida Reduce la tasa de error de 1 en a 1 en 100 millones de bases

26 ¡Rápido y preciso! A E. coli le toma <1 hora para copiar los 5 millones de pares de bases de su único cromosoma Se divide para formar 2 células hijas idénticas Células humanas copian sus 3 mil millones de bases y se dividen en células hijas en sólo unas pocas horas Extremadamente preciso solo ~1 error por 100 millones de bases ~30 errores por ciclo celular

27 ¿A qué se parece realmente?
1 2 3 4

28 ¿Qué les parece? 2011 Esta Animación es muy buena