REPLICACION VIRAL Dra: Harlen Padilla MDV 10/09/2018.

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1 REPLICACION VIRAL Dra: Harlen Padilla MDV 10/09/2018

2 Etapas Unión a la superficie celular (adsorción) Penetración Maduración Estrategias de replicación Modificaciones post-transcripcionales Liberación

3 Adsorción Ligandos Receptores Glicolipids Glicoproteins (H antigen) Proteoglicanos

4 Adsorción Glucosaminoglucanos: Heparan Sulfato Chondroitin Proteoglucanos Proteinas fibrosas Estructurales (Colageno y elastina) Adesivas (Fibronectin y Laminin) Integrinas

5 Penetración Endocitosis mediada por receptores Endocitosis Tránsito por el citoplasma Fusión con endosomas La acidificación activa cambios estructurales en el virion VP4 en Picornaviruses HA en influenza

6 Penetración Fusión con la membrana (virusenvueltos) Fusión directa a pH 7 (Paramixovirus) Liberación de la nucleocapside Inyección de los ácidos nucleídos

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8 Maduración PENETRACCIO N Y DESNUDO

9 Estrategias de Replicación Virus de ADN: Transcripción de mRNA Replicación del ADN Splicing (polycistronic - > moncistronic) +ssRNA El genoma funciona como mRNA -ssRNA (acarrean RdRp) ds RNA (acarrean RdRp

10 En el citoplasma no hay acceso al splicing ARN segmentado Terminación y reiniciación de la transcripción Traslape Traslación en poli-proteínas que son proteolíticamente

11 Estrategias de Replicación +ssRNA Entran directamente a la sintesis de proteinas. ADN en el nucleo: DNA-dependent RNA pol II dsDNA que se replica en el citoplasma: Double-stranded RNA-dependent RNA pol -ssRNA RNA-dependent RNA pol

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16 Como se investiga el tiempo de replicación  Curva de crecimiento de un solo paso  Alta multiplicidad de la infección (MOI)  Duracion de un ciclo de replicación (2 - 12 horas)  Periodo de Eclipse

17 Periodo de Eclipse Expresión temprana de genes Proteínas que detienen la sintesis de ADN y proteínas celulares Proteínas que regulan la expresion del genoma viral Enzimas necesarias para la replicación viral. Expresión tardia de genes Proteinas estructurales usadas para el emsamblaje de nuevas particulas virales Proteínas usadas en las modificaciones post-traslacionales

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19 La célula actúa como una fábrica, proporcionando los sustratos, la energía y la maquinaria necesarias para la síntesis de las proteínas víricas y la replicación del genoma. Los procesos que no lleva a cabo la célula han de estar codificados por el genoma del virus. El modo como cada virus realiza estos pasos y supera las limitaciones bioquímicas de la célula depende de la estructura del genoma y del virión si presenta envoltura o bien una cápside desnuda. La replicación vírica se puede dividir en varias fases:fase precoz de la infección, el virus debe reconocer una célula diana apropiada, unirse a ella, atravesar la membrana plasmática, ser captado por la célula, liberar su genoma (eliminación de la cubierta) en el citoplasma y, si es preciso, introducirlo en el núcleo.

20 La fase tardía comienza:con el inicio de la replicación del genoma y la síntesis de macromoléculas víricas, prosiguiendo con el ensamblaje y la liberación del virus. La desaparición de la cubierta del genoma (cápside o envoltura) que ocurre durante la fase precoz, hace que el virus pierda su carácter infeccioso y deje de ser una estructura identificable, con lo que se entra en el llamado período de eclipse. Al igual que en un eclipse solar, el período de eclipse termina con la aparición de nuevos viriones tras el ensamblaje del virus. El período de latericia, durante el cual no se detecta la presencia de un virus infeccioso en el espacio extracelular, incluye el período de eclipse y finaliza con la liberación de los nuevos virus. Aunque cada célula infectada puede producir hasta 100.000 partículas, tan sólo un 1 a 10% de ellas llegará a ser infecciosa.

21 Las partículas no infecciosas (partículas defectuosas) aparecen debido a mutaciones y errores en los procesos de síntesis y ensamblaje del virión. El rendimiento de virus infecciosos por célula (tamaño de estallido o burst size), así como el tiempo necesario para que ocurra un ciclo de replicación del virus, dependen de las propiedades tanto de este como de la célula diana. RECONOCIMIENTO Y UNIÓN A LA CÉLULA DIANA Lo que en principio determina cuáles son las células que van a ser infectadas por un virus es la unión de las proteínas de fijación del virus (VAP) o de las estructuras localizadas en la superficie de la cápside del virión (tabla 6-5) a los receptores de la célula (tabla 6-6)

22 La célula diana susceptible es la que define el tropismo tisular (p. ej., tropismo neurotrópico o linfotrópico).El virus de Epstein-Barr. La estructura de unión vírica de un virus con cápside puede formar parte de la misma o bien ser una proteína que sale de ella. Un «cañón» localizado sobre la superficie de los picornavirus. Las fibras del adenovirus y las proteínas a-1 de los reovirus situadas en los vértices de la cápside interaccionan con los receptores que se expresan en la superficie de células diana específicas.

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24 PENETRACION Muchas de las interacciones que tienen lugar entre las proteínas de fijación del virus (VAP) y los receptores celulares se inician con la «internalización» del virus hacia el interior de la célula. El mecanismo de internalización depende de la estructura del virión y el tipo de célula. La mayor parte de los virus sin envoltura entran en la célula por una endocitosis es un proceso normal que utiliza la célula para la captación de moléculas unidas receptores, como hormonas, lipoproteínas de baja densidad y transferrina. Los picornavirus y los papovavirus pueden entrar en la célula por viropexia. A veces tras la unión del virus a las células se exponen unas estructuras hidrófobas de las proteínas de la cápside que facilitan el deslizamiento del virus o el genoma vírico a través de la membrana (penetración directa).

25 Los virus con envoltura fusionan sus membranas a las membranas celulares para transferir así la nucleocápside o el genoma directamente al interior del citoplasma. El pH óptimo de la fusión determina si la penetración ocurre en la superficie celular a un pH neutro o si el virus debe ser internalizado por endocitosis (en cuyo caso la fusión se produce en el interior de un endosoma a un pH ácido). Asimismo, los paramixovirus poseen una proteína de fusión (activa a un pH neutro)para facilitar la fusión del virus a la célula. Igualmente, los paramixovirus pueden favorecer la fusión de una célula a otra formando así células gigantes multinucleadas (sincitios). Algunos virus herpes y retrovirus se fusionan con las células en un pH neutro e inducen la aparición de sincitios tras la replicación.

26 PÉRDIDA DE LA COBERTURA Una vez internalizada, la nucleocápside debe llegar al lugar de replicación del interior de la célula y eliminar la cápside o la envoltura. Con excepción de los poxvirus, el genoma de los virus de ADN debe introducirse en el núcleo; en cambio, la mayor parte de los virus de ARN permanece en el citoplasma. La pérdida de la cobertura puede iniciarse por unión con el receptor o verse facilitada por el ambiente ácido o las proteasas presentes en el endosoma o lisosoma. Las moléculas de VP4 se liberan mediante la inserción del receptor en un sitio de unión especial de la cápside que tiene forma de «cañón con ojo de cerradura. Los virus con envoltura la pierden al fusionarse a las membranas celulares. La fusión de la envoltura del virus herpes a la membrana plasmática provoca la liberación de su nucleocápside, que a continuación se «acopla» a la membrana nuclear para enviar directamente su genoma de ADN al lugar donde se produce la replicación.

27 Durante la fase inicial del proceso de pérdida de la cobertura, los poxvirus exponen una partícula subvírica en el citoplasma, lo que permite que las enzimas del virión puedan sintetizar el ARNm. A continuación, se sintetiza una enzima sin cobertura que provoca la liberación en el citoplasma del núcleo vírico (core) que contiene ADN. SÍNTESIS DE MACROMOLÉCULAS: Una vez en el interior de la célula, el genoma debe dirigir la síntesis de ARNm y las proteínas y producir copias idénticas de sí mismo. Por tanto, los pasos que podrían estar dotados de una mayor importancia en la multiplicación de los virus son los procesos de transcripción, traducción y replicación del genoma. El genoma carece de utilidad a menos que pueda transcribirse en unos ARNm funcionales capaces de fijarse a los ribosomas y experimentar un proceso de traducción en proteínas. El modo con que cada virus consigue realizar estos pasos depende de la estructura del genoma

28 La maquinaria celular necesaria para la transcripción y el procesamiento de ARNm se encuentra en el núcleo. Para la producción de ARNm, la mayor parte de los virus de ADN utiliza la polimerasa de ARN II dependiente de ADN, así como otras enzimas. La mayor parte de los virus de ARN se replican y producen ARNm en el citoplasma, salvo los ortomixovirus y los retrovirus. Los virus de ARN deben codificar las enzimas necesarias para la transcripción y la replicación, puesto que la célula no cuenta con mecanismos de replicación de ARN.

29 VIRUS ADN La replicación del genoma de ADN precisa de una polimerasa de ADN dependiente de ADN, otras enzimas y trifosfatos desoxirribonucleicos, en especial de timidina (cuadro 6-7). La transcripción del genoma del virus de ADN (a excepción de los poxvirus) tiene lugar en el núcleo, donde se utilizan las desoxirribonucleasas, polimerasas y otras enzimas de la célula anfitriona para la síntesis de ARNm vírico. La transcripción génica se regula por la interacción existente entre proteínas específicas de unión del ADN al promotor y los elementos facilitadores presentes en el genoma vírico.

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31 FIGURA 6-12. Replicación del virus del herpes simple, un virus ADN complejo y con envoltura. El virus se une a receptores específicos y se fusiona con la membrana plasmática. A continuación la nucleocápside suministra el genoma de ADN al núcleo. La transcripción y la traducción ocurren en tres fases: inmediata precoz, precoz y tardía. Las proteínas de la fase inmediata precoz favorecen la «captura» de la célula; las proteínas de la fase precoz están formadas por enzimas, como la ADN-polimerasa ADN dependiente, y las proteínas de la fase tardía son proteínas estructurales, como la cápside vírica y las glucoproteínas. El genoma se replica antes de que ocurra la transcripción de los genes de la fase tardía. Las proteínas de la cápside migran hacia el interior del núcleo, se ensamblan en las cápsides icosaédricas y se llenan con el genoma del ADN. Las glucoproteínas víricas se insertan en el retículo endoplásmlco, y luego se unen a hidratos de carbono. A continuación las glucoproteínas difunden hacia la envoltura nuclear adyacente. A través de estas membranas modificadas, las cápsides llenas con el genoma forman yemas y luego son transferidas al aparato de Golgi; después se procesan las glucoproteínas y se libera el virus por exocitosis o porl isis celular.

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34 FIGURA 6-11. Pasos de la síntesis de macromoléculas en los virus. El mecanismo de la síntesis de las proteínas y el ARNm, así como la replicación del virus, están determinados por la estructura del genoma. 1. El ADN bicatenario (ADN be) utiliza la maquinaria del anfitrión localizada en el núcleo (a excepción de los poxvirus) para producir el ARNm, que es traducido (por los ribosomas de la célula anfitrión) en proteínas. La replicación del ADN vírico se realiza de un modo conservador (por enroscamiento circular y también por otros medios). 2. El ADN monocatenario (ADN me) se convierte en ADN be y se replica del mismo modo que este último. 3. El ARN+ se asemeja al ARNm en que se fija a los ribosomas para producir una poliproteína que posteriormente es escindida en proteínas individuales. Una de las proteínas víricas es una ARN-polimerasa que produce una plantilla de ARN (-) y, a continuación, una mayor cantidad de genomas ARN+ y ARNm. 4. El ARN- es transcrito en los ARNm y en una plantilla de ARN+ por una ARN-polimerasa contenida en el virión. La plantilla de ARN (+) se utiliza para producir la progenie del genoma ARN (-). 5. El ARN be actúa como el ARN-. Las cadenas (-) son transcritas en los ARNm mediante la acción de una ARN-polimerasa contenida en la cápside. Posteriormente los ARN+ adquieren cápside y los ARN- se producen en el interior de la cápside. 6. Los retrovirus son ARN+ que se convierten en ADN (copia del ADN o ADNc) mediante la acción de una transcriptasa inversa presente en el interior del virión. La ADNc se integra en el interior del cromosoma del anfitrión, y este se encarga de producir los ARNm, las proteínas y las copias completas del genoma de ARN.

35 Replicación de los picomavirus: un virus de ARN (+)simple. 1, La interacción de los picomavirus con los receptores localizados en la superficie celular define la célula diana y debilita la cápside. 2, El genoma inyectado a través del virión atraviesa la membrana celular.2') El virión experimenta un proceso de endocitosis, tras lo cual se liberael genoma. 3, En ocasiones se utiliza el genoma como ARNm para la síntesis de proteínas. A partir del genoma del virión, se traduce una poliproteína de gran tamaño. 4, A continuación, la poliproteína es escindida por proteólisis en proteínas individuales, incluida una ARN- polimerasa ARN dependiente. 5, A partir del genoma, la polimerasa produce una plantilla de cadena (-) y el genoma se replica. Una proteína (VPg) se une mediante un enlace covalente al extremo 5' del genoma vírico. 6, Las proteínas estructurales se asocian en el interior de la cápside, se inserta el genoma y los viriones se liberan durante la lisis de la célula.

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37 Replicación de los rhabdovirus: un virus de ARN (-) con envoltura. 1, Los rhabdovirus se unen a la superficie de la célula y a continuación experimentan un proceso de endocitosis 2, La envoltura se fusiona con la membrana de la vesícula endosómica para suministrar asila nucleocápside al citoplasma. El virión debe contener una polimerasa, enzima que 3, produce cinco ARN mensajeros (ARNm) individuales y una plantilla completa de ARN (+). 4, Se traducen las proteínas a partir de los ARNm, incluyendo una glucoproteína (G) que es glucosilada en el retículo endoplásmico (RE), procesada luego en el aparato de Golgi, y suministrada finalmente a la membrana celular. 5, El genoma se replica a partir de la plantilla de ARN (+), y las proteínas N, Ly NS se asocian con el genoma para formar la nucleocápside. 6, La proteína matricial se asocia a la membrana (modificada por la proteína G), tras lo cual ocurre el ensamblaje de la nucleocápside. 7, El virus sale por gemación a partir de la célula (como virión en forma de proyectil)