AUXINAS (del griego auxein: aumentar o crecer)

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1 AUXINAS (del griego auxein: aumentar o crecer)

2 Historia 1880: Darwin. Describe efecto del luz en coleoptilos (hoja modificada que protege epicótilo) de zacate canarias (Phalaris canariensis). Coleoptilo se dobla hacia la luz, pero no si se cubre punta, no así si se cubre su base y se irradia. Darwin describe un efecto, y responsabiliza al ápice como receptor de la señal que luego es transportada.

3 Ápice es responsable de percibir la luz y producir una señal que se transporta a la base del coleoptilo donde se da la respuesta. Hay estímulo y que este se transmite por lado oscuro de coleoptilo. Estímulo viaja por lado opuesto a fuente de luz. Salkowski descubre el IAA en un medio de fermentación pero hasta 50 años después se encuentra en plantas. 1913 Boysen-Jensen, demuestran que hay estímulo y que este se transmite por lado oscuro de coleoptilo. Paal 1918 corrobora observaciones, estímulo viaja por lado opuesto a fuente de luz. Went 1926: desarrolla el test de curvatura de la avena y promueve investigación en RC. Test de curvatura de la avena y promueve investigación en RC.

4 Otros bioensayos Test de Curvatura de Avena
Estimulación del crecimiento en tallos de arberja, 1951 Inhibición de crecimiento de raíces, 1955 Se crea ensayo biológico que demuestra que a mayor concentración de auxina se da una mayor curvatura. Se determina la concentración en los bloques de agar, curva de conc vs curvatura. Se estudia el efecto del AIA. Se ponen segmentos de tallo en solución de auxina. Se observa efecto en tallos etiolados y no etiolados. En los etiolados a menor concentración se da mayor respuesta, alcanza un máximo y luego es inhibitorio. Cómo se explica esto? Es el mismo tejido, mismo ADN, misma concentración. Receptores? En raíces de arberja el AIA inhibe la elongación. Misma concentración. Test de Curvatura de Avena

5 Definición Son compuestos que inducen:
Inducen curvatura en prueba de coleoptilos de avena. Induce enraizamiento. Elongación celular División celular en presencia de citoquininas en callos de tabaco. Formación de callos en cortes de tallo de tabaco. Induce crecimiento partenocárpico en frutos de tomate. Induce producción de etileno. Inicialmente los compuestos del tipo auxínico eran descritos como aquellos que cumplían las funciones descritas por los ensayas de curvatura del coeoptilo. Hoy se han incluído otras características tales como la capacidad de inducir enraizamiento o de promover división celular en cultivos in vitro

6 Sitios de síntesis Meristemos Hojas jóvenes Embriones Semillas
Tejidos en expansión Es bajo en puntas de raíz y hojas maduras Se podría asumir que el AIA es sintetizado en las partes jóvenes, pero esto no está aún confirmado. Es posible que venga de otros sitio. Falta aislar genes de síntesis y luego localizar su sitio de expresión.

7 Auxinas naturales Ácido indole 3 butírico (AIB)
El AIA es la auxina natural más común. Presente en: plantas vasculares, dicots, monocots, gimnosp, y helechos. Se reporta también en mosses y liverworts. A ph neutro: es un ácido débil y a ph neutro está disociada 4-Cl-IAA: es la forma más común en algunas leguminosas y puede ser hasta 10X más fuerte que AIA. PAA: es un compuesto no indólico reportado en muchas plantas. AIB: se creía que era sintético pero hoy se sabe que es natural en maiz, arberja y arbd. Se deriva del AIA Ácido indole 3 butírico (AIB)

8 Auxinas sintéticas natural
NAA y 2,4 D son muy usadas a bajas concentraciones in vitro para inducir crecimiento y división celular, pegue de frutos y enraizamiento. Estos compuestos tienen la ventaja de que son más estables. Por qué? Mecanismo de degradación no presente. 2,4D , 2,4,5 T , MCPA en concentraciones altas son herbicidas de plantas de hoja ancha al parecer pueden ser metabolizados por plantas de hoja angosta. Cómo pueden compuestos no auxínicos (estructuralmente) inducir respuesta auxínica. a. actúan inhibiendo la inactivación del AIA b. promueven la síntesis de AIA. c. mimetizando compuestos auxínicos

9 Detección Bioensayos HPLC-MS Inmunoensayos
Cromatografía líquida de alta presión y espectrometría de masas Uso de curvas patrón Inmunoensayos Uso de anticuerpos específicos Inmunoensayos a partir de extracto de tejidos, órganos o la planta o hibridización in situ.

10 BIOSÍNTESIS Ruta del ácido shikímico
Aunque se aisló desde 1933 su biosíntesis aún no se conoce por completo. El estudio de la biosíntesis del AIA ha sido difícil. Se ha hecho adicionando precursores marcados para ver su incorporación en el AIA, pero estas medidas han sido difíciles por las concentraciones bajas del AIA en la planta. La identificación de mutantes en la síntesis no ha sido una técnica útil posiblemente porque: 1. mutantes no son viables 2. mutantes no son identificables porque existen rutas alternas a síntesis de auxinas En un esquema biosintético más amplio, el AIA es sintetizado en la ruta del acido shikímico. En esta ruta se sintetizan 3 aa, fenilalanina, tirosina y triptofano. Otros compuestos importantes incluyen alkaloides, coumarinas lignina, antocianinas

11 Biosíntesis Citoplasma TRP Triptamine (TAM) N Hidroxi triptamine
Indole acetaldoxime Indole acetaldehide IAA Hasta finales de los 90 se creía que el único precursor era el aminoácido TRP. El uso de mutantes que no producen TRP ha cambiado radicalmente esta percepción. Ahora se sabe -que existen múltiples rutas de síntesis, -se puede derivar de diferentes precursores en diferentes plantas -diferente precursor en misma planta -diferente precursor según etapa de desarrollo (developmentally regulated)

12 Biosíntesis Cloroplasto Citoplasma IPA Bartel et al. 2001
Indole 3 glicerol P TRP (Cytocromo) Indole 3 acetaldoxime Indole 3 glucosinate Indole 3 acetonitrile TRP Triptamine (TAM) N Hidroxi triptamine Indole acetaldoxime Indole acetaldehide IAA IPA Indole 3 Piruvato ???? Ruta de IPA es la más común en plantas. Vía triptamina se ha detectado en algunas ocasiones. Via acetonitrile ocurre en el cloroplasto. Se ha detectado en familia de la mostaza. Bartel et al. 2001 IAA TRP dep, IAA de respuesta Glucosinate es molécula de almacenamiento

13 Evidencida de ruta independiente del TRP
Mutantes de TRP si se encuentran: trp2, trp3 estos sintetizan 50X más AIA Al marcar con N15 el atranilato en mutante ORP solo marca IAA y no TRP Trp2 y trp3 no acumulan TRP si IAA Al marcar agua con deuterio se marca más AIA que TRP Lemma, N15 TRP muy poco AIA marcado En maiz antranilato induce respuestas tipo auxínico pero TRP no Trp1 fenotipo de AIA def. plt ramifica posterior a Trp1 En conclusión: La biosíntesis del AIA en plantas superiores ocurre en más de una forma y utiliza más de un precursor. Al parecer la el uso de la ruta TRP-dep es utilizada por la planta para cumplir con necesidades específicas de AIA mientras que la ruta TRP-indep produce un nivel constitutivo de AIA.

14 Biosíntesis Cloroplasto Citoplasma IPA Bartel et al. 2001
Indole 3 glicerol P TRP (Cytocromo) Indole 3 acetaldoxime Indole 3 glucosinate Indole 3 acetonitrile TRP Triptamine (TAM) N Hidroxi triptamine Indole acetaldoxime Indole acetaldehide IAA IPA Indole 3 Piruvato ???? Evidencia de una ruta indepeniente del TRP AIA inducido por vía independiente al TRP produce AIA constitutivo. Bartel et al. 2001 IAA TRP indep produce IAA constitutivo

15 Catabolismo Remoción irreversible de IAA 2 vías principales Productos
Oxidación de anillo indole (más común) Decarboxilación de cadena lateral Productos 2 oxindole 3 ácido acético Indole 3 acetyl ácido aspártico No se conocen los genes asociados a estos procesos. La concentración de ambos aumenta la aumentar el IAA libre. Compuestos con grupo indole son sensibles a la luz Solución de AIA se degrada Ambas reacciones son oxidativas pero solo una libera CO2.

16 Catabolismo Actividad de la oxidasa
Oxidasa: Respuesta no depende solo de concentración, también de reacciones como degradación.

17 Conjugación Combinación reversible de IAA con diferentes compuestos y se usan en momentos específicos Se almacenan en vacuolas y/o ret. endopl. Compuestos son transportables Tipo de conjugación depende de especie y de etapa del desarrollo Conjugados son liberados por hidrólisis Mayoría de enzimas de hidrólisis en RE Reacciones ocurren en RE, plt conjugados viajan de sitios de almacenamiento a RE para su modificación.

18 Conjugación Azúcares Azúcares-alcohol Aminoácidos Péptidos Proteínas
Aspartico Glutamina Alanina Glicina Valina Péptidos Proteínas La mayor parte del AIA ocurre en la forma conjugada IAA-aminoácidos: son los conjugados más comunes, en Arbd 90 %, solo 1% como AIA libre

19 Transporte Movimiento basípeto en tallos, acrópeto en raíces. 1 cm/hr
Sistema saturable Movimiento polar permite regulación del crecimiento y desarrollo

20 Transporte Nature Chemical Biology 5, 325 - 332 (2009)
Modelo Quimiosmótico de transporte Auxina entra pasivamente o via transportador ATPasa saca H+ de citosol y acidifica pared Bajo pH en pared mantiene IAA-H asociado y al entras se disocia IAA es transportado a la base de la célula o se acumula en citosol o cloroplasto Figure 4 Phloem-based transport and chemiosmotic model for polar auxin transport. (a) Auxin distribution via the phloem from source tissues—young leaves and floral buds—to root and shoot tips. (b) The chemiosmotic model, based on the pH difference between the apoplast (pH 5.5) and the cytoplasm (pH 7.0). Protonated auxin—undissociated indole-3-acetic acid (IAAH)—can diffuse through the lipidic plasma membrane or be transported by the AUX1/LAX influx carriers into the cell. In the cytosol, it dissociates and gets trapped inside the cell in its deprotonated form (IAA–). IAA– can exit cells by the action of PGP- or PIN-type efflux carriers. The polar cellular localization of the carriers determines the directionality of the intercellular auxin flow. (c) Structure of protonated IAAH. PGP Phosphoglycoproteins ayudan al transporte de IAA con ATPs, pueden actuar sinergística o antagonisticamente con AIA exporters Nature Chemical Biology 5, (2009)

21 Homeostasis Evidencia de homeostasis
En mutantes trp2 y trp3 falta de TRP y aumento de AIA-aa pero AIA libre se mantuvo constante En mutante de amt1, trp5 se pierde control de retroalimentación pero AIA libre se mantiene constante y conjugados aumentan En Lemma gibba amt1 aumenta catabolismo no conjugación En plantas transformadas para producir exceso de AIA se producen alto contenidos de conjugados. Sobreproducción Incremento en el número de raíces laterales y adventicias Ausencia de gancho apical cuando las plántula crecen en la oscuridad Cotiledones y hojas epinásticos Esterilidad debido a no desarrollo de la flor En RESUMEN Los niveles de AIA son regulados muy precisamente por la combinación de varios mecanismos

22 Aplicaciones exógenas
Al hacer aplicaciones se observa que muy poco del AIA queda libre, ya que la planta tiene sistema para controlar exceso de AIA

23 Efectos Fisiológicos Define patrón de desarrollo en embrión
División celular Elongación del coleoptilo y del tallo Enraizamiento Diferenciación del tejido vascular Desarrollo de frutos Tropismos Está involucrada en todo proceso de crecimiento y desarrollo, del embrión a la planta adulta Desarrollo del patrón de desarrollo en el embrión

24 Dominancia Apical

25 Elongación Celular

26 Tropismos En raiz: En crecimiento vertical AIA proviene de parte apical de planta y se distribuye uniformemente hacia arriba favoreciendo el crecimiento. Al colocar raiz en posición horizontal AIA se distribuye asimétricamente. AIA en base causa inhibición de crecimiento en estas células lo que causa curvatura En ápice: y b. Sin luz y con luz lateral la misma concentración. No hay degradación. c. Al dividir ápice con mica e irradiar luz lateral no hay diferencia en ambos lados d. Al eliminar división, se da distribución desuniforme. AIA en lado de mayor concentración permite mayor alargamiento.

27 Otros efectos fisiológicos
Formación de raíces laterales Retarda abscición de frutos Regula el desarrollo de yemas florales Promueve el desarrollo de frutos partenocárpicos Induce diferenciación vascular

28 Genética Molecular Respuesta molecular asociada al crecimiento
Receptor (ABP1) Transducción Respuesta Rápida Bomba de protones Secreción Respuesta Lenta Activación de proteínas reguldoras Síntesis de mRNA Síntesis de proteínas de crecimiento

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30 Genes asociados a auxinas
Aux/IAA: genes asociados a adición de IAA ARF: Gen que produce proteína que se une a promotor de genes que responden ante presencia de auxina. Síntesis constitutiva. ARE: sección del promotor en genes inducidos por presencia de auxina. A esta se une ARF. Esencial para activación de estos genes. DBD: sitio de unión al ADN. Se une a genes que responden ante adición de auxina ARF y Aux/IAA pueden homo y heterdimerizar

31 Regulación de síntesis de proteínas
ARF unidos siempre a ARE indep. de nivel de auxinas. Nivel bajo de auxinas: Aux/IAA estables y dimerizan con ARF ARF es bloqueado Aumento de nivel de auxinas: Se desestabiliza Aux/IAA Se libera ARF. Se sintetizan genes dep de auxinas (Aux/IAA) Al aumentar Aux/IAA se forma ARF/Aux/IAA Se activa degradación de Aux/IAA

32 Degradación de genes inducidos por auxinas: ubiquitinación
Degradación de proteínas inducidas por presencia de auxina es importante porque reacción no puede ser continua. Sistema debe estar listo para nueva inducción de auxinas.

33 Regulación por ubiquitinación
Figure I Auxin regulates the ubiquitination of target proteins, marking them for degrada- tion by the 26S proteasome. T'he figure shows key components of this pathway. Ubiquitin (Ub) must be activated before conjugation to specific targets (top left). Target selection is mediated by the F-box---,containing subunit of an SCF-type ubiquitin protein ligase (center). Auxin-regulated modification of the targets, which include the Aux/LAA proteins, is likely to be required for recognition by the F-box protein (,right-hand side). Efficient activity of the SCF requires conjugation and deconj ugation of a ubiquitin-related protein of the Rub fknily to the Cullin (Cul) subunit of the SCF (bottom left). Like ubiquitin, Rub must be activated before conjugation by a dimenc enzyme with homology to ubiquitin-activating enzyme. De- conjugation of Rub requires the Cop 9 complex. It is not clear if Rub protein is recycled during this process. In Arabidepsis, mutations, including axr], ecrl, axr2, axr3, and tirl, in components of this pathway result in defective auxin response. eff.Eyale efizyam Figure I Auxin regulates the ubiquitination of target proteins, marking them for degrada- tion by the 26S proteasome. T'he figure shows key components of this pathway. Ubiquitin (Ub) must be activated before conjugation to specific targets (top left). Target selection is mediated by the F-box---,containing subunit of an SCF-type ubiquitin protein ligase (center). Auxin-regulated modification of the targets, which include the Aux/LAA proteins, is likely to be required for recognition by the F-box protein (,right-hand side). Efficient activity of the SCF requires conjugation and deconj ugation of a ubiquitin-related protein of the Rub fknily to the Cullin (Cul) subunit of the SCF (bottom left). Like ubiquitin, Rub must be activated before conjugation by a dimenc enzyme with homology to ubiquitin-activating enzyme. De- conjugation of Rub requires the Cop 9 complex. It is not clear if Rub protein is recycled during this process. In Arabidepsis, mutations, including axr], ecrl, axr2, axr3, and tirl, in components of this pathway result in defective auxin response.

34 ABP1 Presente en todas las plantas Detectado en 1977 y purificado 1985
Se une con gran afinidad a las auxinas Su rol no es claro Terminal-carboxilo muestra 2 configuraciones con y sin aux Auxinas inducen resp lenta (cambios en expresión de genes y resp rápidas como cambios en la membrana

35 Auxinas inducen resp lenta (cambios en expresión de genes y resp rápidas como cambios en la membrana
Las rápidas no se asocian a procesos de regulación de la TC, pej hiperpolarización de la pl, hinchamiento de de los protoplastos que se inducen segundos después de la adición de auxinas:transp de iones y osmorregulación de la membrana Localizada: en PL pero tiene KDEL seq que la localiza en RE, mayoria en RE pero aquí pH muy alto para union de auxinas

36 TIR1 Las auxinas regulan la TC al promover la degradación de genes Aux/IAA . La auxina se une a TIR 1 (proteína tipo F-box) en el sitio SCF-TIR1 y la estabiliza Aux/IAA se poliubiquitina y es degradado en el proteosoma La pérdida del represor permite a la expresión de los genes depend. De ARF Auxin regulates transcription by promoting ubiquitin (Ub)-mediated degradation of Aux/IAA repressors. Auxin (A) binds to the F-box protein TIR1 in SCFTIR1 and stabilizes the interaction between TIR1 and an Aux/IAA substrate. The repressor is polyubiquitinated and degraded by the 26S proteasome. Loss of the Aux/IAA permits auxin response factor (ARF)- dependent transcription of auxin-regulated genes. E2, Ub-conjugating enzyme

37 Percepción de las auxinas por TIR1.
Auxin perception by the F-box protein TIR1. (a) Structure of TIR1 ( gray) in complex with ASK1 (dark blue), indole-3-acetic acid (IAA) ( green), Aux/IAA domain II peptide (orange), and inositol hexakisphosphate (red ). (b) Close-up of the auxin-binding pocket occupied by IAA ( green). Surrounding TIR1 residues are shown in yellow. Dashed pink lines indicate hydrogen bonds between the carboxyl group of IAA and conserved R403. (c) Surface view of TIR1 in complex with IAA ( green) and domain II peptide (orange). The Auxin Receptor Structure Includes InsP6 Another surprising feature of the TIR1 structure is the presence of a single inositol hexakisphosphate (InsP6) molecule in the floor of the LRR domain (Figure 2). The position of InsP6 appears to be critical for stabilizing the structure of the auxin-binding pocket. InsP6 is found in all eukaryotes, and its putative role in a wide variety of cellular processes is beginning to be explored (Macbeth et al. 2005, Mulugu et al. 2007, Odom et al. 2000, Seeds & York 2007). In plants, InsP6 (also called phyate) is an extremely abundant compound that has so far attracted attention primarily because of its animal antinutrient properties (Raboy 2007). Recent genetic studies suggest that it may have an important role in phosphate storage and signaling (Stevenson-Paulik et al. 2005). Currently it is not clear whether InsP6 binding to TIR1 has a regulatory function or a structural function, although the abundance of InsP6 in plant cells suggests the latter. Further studies are required to establish a role of InsP6 in TIR1 function and auxin signaling En gris la estructura de TIR1 en asocio con ASK1 (azul oscuro) e AIA (verde), Aux/IAA (anaranjado) inositol hexakisfosfato (rojo) Acercamiento del sitio de unión del AIA Vista plana del TIR1 en complejo con AIA

38 La auxina funciona como una goma molecular que une a dos proteínas para acelerar la destrucción de una de ellas