Introducción al proceso: Colecta de CPH Dra Ina Perez Banco de Sangre Clínica Delgado.

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1 Introducción al proceso: Colecta de CPH Dra Ina Perez Banco de Sangre Clínica Delgado

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10 Sangre periférica En condiciones normales, la cantidad de células madre existente en la sangre circulante por las venas y las arterias es muy escasa. Sin embargo, es posible movilizar grandes cantidades de esas células desde la médula a la sangre y allí recogerlas sin necesidad de anestesia. Para conseguir esta «movilización», los donantes tienen que recibir, durante cuatro o cinco días, una inyección diaria (cada 12 horas) de G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor, por sus siglas en inglés). Este fármaco, modalidad artificial de una proteína que se encuentra en el cuerpo de forma natural, es capaz de movilizar las células madre de la médula ósea a la sangre. La mayoría de los donantes toleran muy bien el G- CSF, aunque puede producir molestias tales co mo cansancio, dolor de cabeza, dolores óseos y musculares, o síntomas similares a los de una gripe. Estos efectos secundarios son transitorios, mejoran con la toma de paracetamol y ceden al dejar de administrar el G-CSF. En condiciones normales, la cantidad de células madre existente en la sangre circulante por las venas y las arterias es muy escasa. Sin embargo, es posible movilizar grandes cantidades de esas células desde la médula a la sangre y allí recogerlas sin necesidad de anestesia. Para conseguir esta «movilización», los donantes tienen que recibir, durante cuatro o cinco días, una inyección diaria (cada 12 horas) de G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor, por sus siglas en inglés). Este fármaco, modalidad artificial de una proteína que se encuentra en el cuerpo de forma natural, es capaz de movilizar las células madre de la médula ósea a la sangre. La mayoría de los donantes toleran muy bien el G- CSF, aunque puede producir molestias tales co mo cansancio, dolor de cabeza, dolores óseos y musculares, o síntomas similares a los de una gripe. Estos efectos secundarios son transitorios, mejoran con la toma de paracetamol y ceden al dejar de administrar el G-CSF.

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14 Flujos de Procesos de Colecta de Celulas Movilización: Esquemas dependen de la patología y tipo de trasplante. Métodos de Colecta por aféresis: PBSC vs Linfoferesis Estándares de Colecta: Colectando en Donantes Pediátricos. Movilización: Esquemas dependen de la patología y tipo de trasplante. Métodos de Colecta por aféresis: PBSC vs Linfoferesis Estándares de Colecta: Colectando en Donantes Pediátricos.

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16 La Cinetica de Movilizacion Durante el estadio de hematopoyesis las concentraciones de células madres pluripotentes y de progenitores circulantes en sangre periférica son relativamente bajos. Estas células conocidas como progenitores hematopoyéticos (CPH) viven en la medula con interacciones con citoadhesinas entre receptores de membrana y ligandos expresados en el estroma celular del microentorno e imbuidas en la matriz del estroma. Dos moléculas de superficie son conocidas: la integrina very late (VLA-4), que se enlaza a la VCAM-1 (molecula de adhesión celular vascular) y la quemoquina CXCR4, que se enlaza al factor derivado del estroma celular 1 (SDF-1). Las CPH migran cuando las interacciones citoadhesivas con interrumpidas. La quimioterapia ablativa estimula a las CPH a dejar su nicho y migrar a la circulación durante el proceso de recuperación. Las células progenitoras también pueden ser inducidas por citokinas que son administradas por vía exógena, tales como los factores estimulantes de colonias de granulocitos(G- CSF),factores estimulantes de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y factores estimulantes de Stem Cell (SCF). Durante el estadio de hematopoyesis las concentraciones de células madres pluripotentes y de progenitores circulantes en sangre periférica son relativamente bajos. Estas células conocidas como progenitores hematopoyéticos (CPH) viven en la medula con interacciones con citoadhesinas entre receptores de membrana y ligandos expresados en el estroma celular del microentorno e imbuidas en la matriz del estroma. Dos moléculas de superficie son conocidas: la integrina very late (VLA-4), que se enlaza a la VCAM-1 (molecula de adhesión celular vascular) y la quemoquina CXCR4, que se enlaza al factor derivado del estroma celular 1 (SDF-1). Las CPH migran cuando las interacciones citoadhesivas con interrumpidas. La quimioterapia ablativa estimula a las CPH a dejar su nicho y migrar a la circulación durante el proceso de recuperación. Las células progenitoras también pueden ser inducidas por citokinas que son administradas por vía exógena, tales como los factores estimulantes de colonias de granulocitos(G- CSF),factores estimulantes de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y factores estimulantes de Stem Cell (SCF).

17 Liberación de células madre Los mecanismos moleculares y biológicos involucrados durante la quimioterapia y la movilización inducida por citocinas están todavía no entendibles del todo, pero parece que las quimoquinas involucradas activan proteasas dentro del micro universo e hidrolizan los puentes de citoadhesinas liberan de esta manera las células progenitoras hematopoyéticas. Los agentes farmacológicos que están siendo desarrollados de esta manera pueden interferir directamente con los interacciones entre los ligandos por ejemplo : CXRC4 y el SDF-1. De esta manera se pueden movilizar células progenitoras rápidamente para su colección y uso el antígeno CD34 es otra molécula químicamente muy importante que se expresa en la superficie de la célula progenitora primitiva, y a pesar de que su función es todavía no del todo definida el CD34+ ha demostrado ser muy útil para identificar, cuantificar y estimar la pureza, tanto de la médula ósea como de la sangre periférica. Se observan diferencias en cuanto a los tipos de CD34, la población de CD34+ que es movilizada a la circulación periférica y a las células CD34+ de la médula ósea, en cuanto a su habilidad de reconstituir la hematopoyesis en condiciones de mieloablación. Los mecanismos moleculares y biológicos involucrados durante la quimioterapia y la movilización inducida por citocinas están todavía no entendibles del todo, pero parece que las quimoquinas involucradas activan proteasas dentro del micro universo e hidrolizan los puentes de citoadhesinas liberan de esta manera las células progenitoras hematopoyéticas. Los agentes farmacológicos que están siendo desarrollados de esta manera pueden interferir directamente con los interacciones entre los ligandos por ejemplo : CXRC4 y el SDF-1. De esta manera se pueden movilizar células progenitoras rápidamente para su colección y uso el antígeno CD34 es otra molécula químicamente muy importante que se expresa en la superficie de la célula progenitora primitiva, y a pesar de que su función es todavía no del todo definida el CD34+ ha demostrado ser muy útil para identificar, cuantificar y estimar la pureza, tanto de la médula ósea como de la sangre periférica. Se observan diferencias en cuanto a los tipos de CD34, la población de CD34+ que es movilizada a la circulación periférica y a las células CD34+ de la médula ósea, en cuanto a su habilidad de reconstituir la hematopoyesis en condiciones de mieloablación.

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19 Características de la Colecta Los números de células CD34 trasplantadas se correlacionan con la cinética del injerto desde mediados de los años 90 en la movilización de células progenitoras hematopoyéticas con quimioterapia y se han convertido en las moléculas favoritas para el marcaje. El CD 34+ movilizadas a sangre periferica exhiben menos actividad en cuanto a su ciclo celular y sus patrones de RNA muestran concentraciones mucho más bajas de la expresión de genes involucrados en la síntesis de DNA, asimismo la iniciación del ciclo celular es más lento y expresan grandes niveles de genes que dirigen la apoptosis. Se reconoce que las células progenitoras derivadas de colecta de aferesis generalmente contienen dos a cinco veces más células CD 34 +, de dos a cinco veces más células dendríticas, y de 2 a 10 veces más linfocitos T y natural killer; asimismo son 20 veces más concentradas en monocitos y linfocitos que sus pares CD34 + en medula osea. En cambio las células progenitoras derivadas de aferesis carecen de concentraciones significativas de células estromales mesenquimales, de progenitores endoteliales,de progenitores osteogénicos y otras células encontradas en el micro ambiente celular usual de la médula ósea. EL hecho que se tenga un contenido relativamente alto de serie CD34+ de las células progenitoras hematopoyéticas obtenidas por aferesis ofrece muchas ventajas sobre las células progenitoras en que se encuentran en la médula osea. Los números de células CD34 trasplantadas se correlacionan con la cinética del injerto desde mediados de los años 90 en la movilización de células progenitoras hematopoyéticas con quimioterapia y se han convertido en las moléculas favoritas para el marcaje. El CD 34+ movilizadas a sangre periferica exhiben menos actividad en cuanto a su ciclo celular y sus patrones de RNA muestran concentraciones mucho más bajas de la expresión de genes involucrados en la síntesis de DNA, asimismo la iniciación del ciclo celular es más lento y expresan grandes niveles de genes que dirigen la apoptosis. Se reconoce que las células progenitoras derivadas de colecta de aferesis generalmente contienen dos a cinco veces más células CD 34 +, de dos a cinco veces más células dendríticas, y de 2 a 10 veces más linfocitos T y natural killer; asimismo son 20 veces más concentradas en monocitos y linfocitos que sus pares CD34 + en medula osea. En cambio las células progenitoras derivadas de aferesis carecen de concentraciones significativas de células estromales mesenquimales, de progenitores endoteliales,de progenitores osteogénicos y otras células encontradas en el micro ambiente celular usual de la médula ósea. EL hecho que se tenga un contenido relativamente alto de serie CD34+ de las células progenitoras hematopoyéticas obtenidas por aferesis ofrece muchas ventajas sobre las células progenitoras en que se encuentran en la médula osea.

20 Recuperacion Se ha reportado de que la recuperación de neutrófilos y plaquetas ocurre de 4 a 7 días más tempranamente que la de los injertos de médula ósea y que la función inmune se recupera más rápido en comparación a los pacientes que reciben solamente colecta de medula. Esto se traduce en menor morbilidad y mortalidad, particularmente en los pacientes que han hecho colecta autologa. La duración y las complicaciones infecciosas asociadas con enfermedad injerto contra huésped parecen ser más intensas en cuanto a los productos de células derivadas por aferesis que en aquellos pacientes que solamente reciben productos colectados de médula ósea y se reporta un incremento importante en el riesgo de desarrollo de enfermedad injerto contra huésped crónico esto esta vinculado en los casos en los cuales sacamos altas dosis de CD34+. Se ha reportado de que la recuperación de neutrófilos y plaquetas ocurre de 4 a 7 días más tempranamente que la de los injertos de médula ósea y que la función inmune se recupera más rápido en comparación a los pacientes que reciben solamente colecta de medula. Esto se traduce en menor morbilidad y mortalidad, particularmente en los pacientes que han hecho colecta autologa. La duración y las complicaciones infecciosas asociadas con enfermedad injerto contra huésped parecen ser más intensas en cuanto a los productos de células derivadas por aferesis que en aquellos pacientes que solamente reciben productos colectados de médula ósea y se reporta un incremento importante en el riesgo de desarrollo de enfermedad injerto contra huésped crónico esto esta vinculado en los casos en los cuales sacamos altas dosis de CD34+.

21 Regimenes de movilización y cinetica Los productos de colecta de aféresis son movilizados con quimioterapia mielosupresiva sola, quimioterapia con estimulación de citokinas o estimulación de citokinas sola. Para los pacientes con cáncer que requieren de terapia citoreductiva la quimioterapia es dada y la colecta de aféresis es realizada durante la fase de recuperación. Los agentes más frecuentemente usados son Filgastrim (G- CSF molécula no glicosilada), Sargramostim (GM-CSF), Lenogastrim (G-CSF molécula glicosilada). La forma pegilada Pegfilgrastrim ha sido usada exitosamente en movilización de pacientes y donantes, ajustando una única dosis. La FDA la recomienda sobre todo en los casos de neutropenia febril. La ciclofosfamida es uno de los agentes quimioterápicos que más moviliza y se utiliza sobretodo en el linfoma no Hodgkin y el Mieloma. En contraste los análogos nucleosidos y agentes alkilantes son menos efectivos como agentes movilizantes y por el contrario reducen las poblaciones de CD34+ disponibles para movilización. Para pacientes que no requieren de quimioterapia y para donantes alogenicos, las células progenitoras hematopoyéticas de la periferie se colectan cuando se alcanzan los picos máximos de estimulación de CD34+. Sea si se usa GM-CSF dos veces al dia o una única dosis de Pegfilgastrim en todo el ciclo estimulatorio, se desencadena una cinetica predecible. EL pico de estimulación ocurre a los cinco días de estimulación con GM-CSF sola. Los productos de colecta de aféresis son movilizados con quimioterapia mielosupresiva sola, quimioterapia con estimulación de citokinas o estimulación de citokinas sola. Para los pacientes con cáncer que requieren de terapia citoreductiva la quimioterapia es dada y la colecta de aféresis es realizada durante la fase de recuperación. Los agentes más frecuentemente usados son Filgastrim (G- CSF molécula no glicosilada), Sargramostim (GM-CSF), Lenogastrim (G-CSF molécula glicosilada). La forma pegilada Pegfilgrastrim ha sido usada exitosamente en movilización de pacientes y donantes, ajustando una única dosis. La FDA la recomienda sobre todo en los casos de neutropenia febril. La ciclofosfamida es uno de los agentes quimioterápicos que más moviliza y se utiliza sobretodo en el linfoma no Hodgkin y el Mieloma. En contraste los análogos nucleosidos y agentes alkilantes son menos efectivos como agentes movilizantes y por el contrario reducen las poblaciones de CD34+ disponibles para movilización. Para pacientes que no requieren de quimioterapia y para donantes alogenicos, las células progenitoras hematopoyéticas de la periferie se colectan cuando se alcanzan los picos máximos de estimulación de CD34+. Sea si se usa GM-CSF dos veces al dia o una única dosis de Pegfilgastrim en todo el ciclo estimulatorio, se desencadena una cinetica predecible. EL pico de estimulación ocurre a los cinco días de estimulación con GM-CSF sola.

22 CD34+ El mejor predictor de la colecta de CD34+ es el recuento tomado de la de las células de muestra periferica y determinado por citometria flujo, cuando la determinación de CD34+ no sea posible se podrá utilizar otros parámetros que nos ayuden a estimar la movilización. Recuento de lamina periferica, recuento de CMN y numero de leucocitos se pueden usar pero son de poca utilidad. Variables que afectan negativamente la movilización: uso previo de agente quimioterapicos toxicos para Stem cells, exposición a terapias mielosupresivas, irradiación de huesos planos, falta de uso de citokinas adyuvantes, medula osea tomada por elulas tumorales, ancianidad, trombocitopenia de base (indicador de una pobre recuperación medular). Un 5-30% de los pacientes son “ pobres movilizadores” y no llegan a generar 2 x10*6 CD34+/kg de peso de dosis. Este es el minimo aceptable para aceptar el éxito del injerto y una posible recuperación medular. El mejor predictor de la colecta de CD34+ es el recuento tomado de la de las células de muestra periferica y determinado por citometria flujo, cuando la determinación de CD34+ no sea posible se podrá utilizar otros parámetros que nos ayuden a estimar la movilización. Recuento de lamina periferica, recuento de CMN y numero de leucocitos se pueden usar pero son de poca utilidad. Variables que afectan negativamente la movilización: uso previo de agente quimioterapicos toxicos para Stem cells, exposición a terapias mielosupresivas, irradiación de huesos planos, falta de uso de citokinas adyuvantes, medula osea tomada por elulas tumorales, ancianidad, trombocitopenia de base (indicador de una pobre recuperación medular). Un 5-30% de los pacientes son “ pobres movilizadores” y no llegan a generar 2 x10*6 CD34+/kg de peso de dosis. Este es el minimo aceptable para aceptar el éxito del injerto y una posible recuperación medular.

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