COCOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS FACULTATIVOS

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1 COCOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS FACULTATIVOS
Tema 5 del tomo I del libro: Granados Pérez, R. y Villaverde Peris, M.C. (2003).- Microbiología. Ed. Paraninfo. Ciclo: Laboratorio de Diagnóstico Clínico Módulo: Fundamentos y Técnicas de Análisis Microbiológico Profesores: José Ángel Pina Alburquerque Antonio Sánchez Moreno

2 INTRODUCCIÓN Cocos Gram +: Comprende tres familias según el Bergey’s Manual: Micrococaceae, Streptococaceae y Peptococaceae. Siendo de mayor interés clínico los géneros Staphylococcus y Streptococcus (de la primera y segunda familia respectivamente). Staphylococcus Catalasa positivos y agrupados en racimos. Streptococcus Catalasa negativos y agrupados en cadenas. Cocos Gram – Neisseria Branhamella

3 Género Staphylococcus. Concepto y caracteres generales.
En el Manual de Bergey: Pertenece a la familia Micrococaceae (junto con los géneros Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus de menor interés clínico) Género Staphylococcus: Cocos G+ inmoviles, anaerobios facultativos no formadores de esporas. Agrupación en racimo. Catalasa positivos Fermentan azúcares Forman parte de la flora normal de la piel y mucosas. Participan en procesos infecciosos (heridas, intoxicaciones alimentarias, etc.)

4 Género Staphylococcus. Especies más importantes
S. aureus (estafilococo dorado): La más patógena. Pigmento no difusible de color amarillo. Produce coagulasa Fermenta el manitol Antígenos en su pared: Polisacárido A y Proteína A S. epidermis y S. saprophyticus: Son oportunistas (presentes en el medio ambiente, piel y mucosas) No producen toxinas ni pigmento amarillo. Coagulasa negativo y manitol negativo.

5 S. aureus. Acción patógena e interés clínico: Antígenos, toxinas y enzimas
ANTÍGENOS DE SUPERFICIE (PARED): Polisacárido A y Proteína A: Presentan propiedades antifagocitarias e inducen a la liberación de factores quimiotácticos que intervienen en la formación de estructuras piógenas (caracteristicas de las lesiones por Staphylococcus).

6 S. aureus. Acción patógena e interés clínico: Antígenos, toxinas y enzimas
HEMOLISISNAS: Exotoxinas citotóxicas muy sensibles al calor (lisan G.R. y afectan a macrófagos y leucocitos). En función del grado de hemólisis en medios de agar sangre a 37º C se clasifican: Hemolisina α: Hemólisis parcial Hemolisina β: Hemólisis total Hemolisina γ: No producen hemólisis en medios de cultivo. Poca importancia patógena aunque pueden intervenir en lesiones y heridas. TOXINA EXFOLIATIVA: Exotoxina causante de eritemas. LEUCOCIDINAS: Destruyen leucocitos (polimorfonucleares y macrófagos) ⇒ Gran resistencia. ENTEROTOXINAS: Exotoxinas que producen vómitos y en menor proporción diarreas.

7 S. Aureus - Hemolisinas

8 S. Aureus - Hemolisinas

9 S. aureus. Acción patógena e interés clínico: Antígenos, toxinas y enzimas
COAGULASA: Coagula el plasma sanguíneo (activa la protrombina) facilitando procesos sépticos localizados FIBRINOLISINAS (en algunos casos): Efecto proteolítico, rompiendo los coágulos de fibrina. PENICILINASA (o β-lactamasas) rompen el anillo β-lactámico de las penicilinas, por lo que provocan resistencia a estos antibióticos. Variables según cepas y sometidos a regulación génica, influenciada por el medio

10 S. aureus. Acción patógena e interés clínico: Antígenos, toxinas y enzimas
S. aureus puede estar presente en la flora normal en piel y mucosa nasal. La patogenicidad depende de la mayor o menor presencia de los factores de virulencia (antígenos, toxinas y enzimas)

11 S. aureus. Acción patógena e interés clínico:
Puede afectar: Piel y mucosas: Forúnculos, infecciones de heridas y quemaduras, procesos inflamatorios, supurativos y piógenos, etc. Impétigo (infección localizada en las lesiones) Síndrome de la piel escaldada (Lesiones debidas a la exotoxina exfoliativa. Infección alejada de las lesiones.) De forma generalizada: Trombos intravenosos (por la coagulasa), septicemia, artritis, endocarditis, pleuritis, etc. en individuos debilitados. Síndrome del shock tóxico (TSS) Aparato digestivo: Cuadros de gastroenteritis por intoxicación alimentaria debido a la enterotoxina producida cuando crece sobre alimentos (sobre todo en cremas ricas en hidratos de carbono). No presenta fiebre (intoxicación, no infección) Sí Nauseas, vómitos y diarreas, 1 a 2 días. Se transmite por manipuladores portadores sanos.

12 Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)
Cepa de Staphylococcus aureus resistente a varios antibióticos: penicilina, meticilina y más recientemente a vancomicina (SARV) Muy propagado en infecciones nosocomiales Actualmente está empezando a detectarse también casos adquiridos en la comunidad (no nosocomiales). HA-MRSA (healthcare-associated MRSA) CA-MRSA (community-associated MRSA) Hipervínculos: Ver artículo científico Ver en Nature

13 Aislamiento de Staphilococcus
Medio selectivo y diferencial: Medio Manitol Salado (Medio Chapman): NaCl: Selectivo para Staphilococcus spp (por su carácter halófilo) Manitol: Fermentación ⇒ Diferencial para S. aureus (manitol +). Tras obtener cultivo puro ⇒ Resiembra en Agar Sangre para ver posible hemólisis y morfología y color de las colonias.

14 Caracteres Bioquímicos de Staphilococcus
Cocos G+ y catalasa + Oxidasa negativos Fermentan muchos azúcares (glucosa, sacarosa, fructosa, etc.) con producción de ácidos. Indol – Gelatinasa + Reducen NO3 a NO2 No poseen fibrinolisinas (excepto excepciones) Coagulasa – (salvo S.aureus) Colonias grandes aplanadas y lisas con alfa y beta hemólisis en agar sangre

15 Caracteres Bioquímicos de Staphilococcus

16 Diagnóstico bacteriológico de Staphilococcus
Toma de muestra con torunda estéril (heridas y lesiones superficiales) o por punción. Tinción de Gram de la muestra Aislamiento: Medio Chapman Cultivo puro en Agar Sangre Pruebas bioquímicas: Coagulasa Fermentación de glucosa en medio O/F Catalasa Gelatinasa Sensibilidad a la novobiocina

17 Diagnóstico bacteriológico de Staphilococcus
Fermentación de glucosa

18 Streptococcus Cocos Gram + Anaerobios facultativos
Agrupación en cadenas Catalasa – Oxidasa – Fermentan la glucosa (producción de ácidos) Solo algunas especies son patógenas. Muchas especies son saprófitas de la flora normal y patógenas oportunistas.

19 Clasificación de Streptococcus
Se clasifican en función de: Tipo de hemólisis. Clasificación de Lancefield: Por los caracteres antigénicos del carbohidrato C de su pared (polisacárido). Comportamiento antigénico frente a diversas pruebas serológicas de aglutinación pasiva, inmunofluorescencia, etc.

20 Streptococcus. Tipo de hemólisis en placas de agar sangre.
γ-hemolítico: No hemólisis α-hemolítico: Tipo viridans (de verde). Hemólisis parcial: Decoloración pardo-verdosa. Ej.: S. pneumoniae β-hemolítico: Hemólisis total⇒ Halos de transparencia grandes alrededor de las colonias.

21 Streptococcus. Clasificación de Lancefield.
Se designan por letras de la A a la V en función de las diferentes características antigénicas que puede presentar el carbohidrato C de su pared. Existen Streptococcus que no tienen carbohidrato C, por lo que no pueden clasificarse en estos grupos. El grupo más importante en patología humana es el A (que son β-hemolíticos, la mayoría). Presentan diferentes factores de virulencia además del carbohidrato C: Proteína M en su pared (propiedades antifagocitarias) En las cápsula: Ácido hialurónico con características antifagocitarias (Grs. A y C) y un carbohidrato asociado a infecciones Respiratorias y nerviosas (S. pneumoniae) Rebeca Lancefield (1895 – 1981)

22 Streptococcus. Clasificación de Lancefield.
Grupo A - Streptococcus pyogenes Grupo B - Streptococcus agalactiae Grupo C - Streptococcus equisimilis, Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus dysgalactiae Grupo D - Enterococcus, Streptococcus bovis Grupo E - Streptococcus milleri y Streptococcus mutans Grupo F - Streptococcus anginosus Grupo G - Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae Grupo H - Streptococus sanguis Grupo L - Streptococcus dysgalactiae Grupo N - Lactococcus lactis Grupo R&S - Streptococcus suis Muchos estreptococos del Grupo D han sido reclasificados y ubicados en el Género Enterococcus

23 Streptococcus. Clasificación por pruebas serológicas + hemólisis + pruebas bioquímicas
Streptococcus β-hemolíticos de los grupos A,B,C,G y F. Streptococcus del grupo D de Lancefield enterococo y Streptococcus del grupo D de Lancefield no enterococo. Streptococcus tipo viridans.

24 Streptococcus Acción patógena e interés Clínico
Streptococcus del grupo A (S. pyogenes). β-hemolíticos Patógenos (suponen el 90% de las infecciones estreptocócicas). Se encuentra en la mucosa nasal y faríngea de los enfermos y también en portadores sanos.

25 Acción patógena e interés clínico en Streptococcus del grupo A (S
Acción patógena e interés clínico en Streptococcus del grupo A (S. pyogenes) Efecto patógeno por factores de virulencia: ANTÍGENOS: Polisacárido C: ⇒ Carácterísticas de grupo. Proteína M (solo en Gr. A): Facilita adherencia y protección frente a fagocitosis. TOXINAS: Hemolisinas: Estreptolisina O y Estreptolisina S (Antigénica y Afecta también a leucocitos) Toxina eritrogénica (⇒Exantema de la escarlatina) ENZIMAS: Estreptoquinasas: ⇒Lisis de fibrina (rotura de coágulos). Desoxiribonucleasa estreptocócica (4 grupos antigénicos A, B, C, y D): Despolimeriza el ADN Hialuronidasas: Hidroliza el ácido hialurónico del tej. conectivo. Proteinasa estreptocócica: Actúa sobre el tejido conectivo ⇒ ayuda a la difusión. ⇒ Procesos inflamatorios y necrosis.

26 Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus del grupo A (S
Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus del grupo A (S. pyogenes) PROCESOS INFECCIOSOS: Localizadas en piel (escarlatina) o mucosas (anginas, sinusitis, etc.) Localizadas en vísceras (endocarditis, meningitis…) Infecciones generalizadas (sepsis)

27 Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus del grupo A (S
Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus del grupo A (S. pyogenes) Los cuadros más frecuentes son de ANGINAS o FARINGITIS Pueden dar lugar a complicaciones: Supuradas: Otitis, sinusitis, meningitis, etc. No supuradas: Glomerulonefritis Fiebres reumáticas (x infecciones no tratadas) afectando a articulaciones e incluso al corazón.

28 Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus del grupo B
Solo una especie: S.agalactiae Saprófito Localización: Rinofaringe, aparato urogenital e intestinal. Patógeno oportunista: En tracto respiratorio, mucosas, piel, etc. y meningitis e infecciones pulmonares en neonatos contagiados a partir de la vagina de la madre. β-Hemolíticos (la mayoría). Descomponen el hipurato sódico

29 Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus del grupo D
β –Hemolíticos (variable por cepas). Resisten a bien agentes externos y antibioticos Enterococos (S. faecalis y S. faecium ahora en el género Enterococcus): Saprófitos del intestino. Crecen bien en medios ricos en NaCl (6,5%) Utilizan la esculina No enterococos (S. bobis y S. equinus) afectan a vacas y caballos. Los enterococos se encuentra en la flora intestinal normal y la infección a menudo procede de contaminación fecal. Son una causa importante de infecciones del tracto urinario (mucho menos común que E. coli) y también infecciones oportunistas (incluyendo infección intra-abdominal, septicemia y endocarditis).

30 Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus de los grupos:
Grupo C, G, F y E : β-Hemolíticos Sensible a agentes externos Saprófito de rinofaringe (G, F y E también vías genitales e intestino). Pocas veces patógenos oportunistas (en vías urinarias, heridas, etc.) Grupos H (S. sanguis) y K (S. salivarius): Saprófitos de la rinofaringe. No patógenos α- y γ-Hemolíticos (cuando lo son) Grupo N (S. thermophilus, S. lactis, etc): Estreptococos lácticos (industria): Fermentadores de lactosa No hemolíticos

31 Acción patógena e interés Clínico en Streptococcus de los grupos:
Grupo viridans: α- y γ-Hemolíticos Saprófitos de orofaringe, mucosa bucal y placa dental. Patógeno oportunista: Caries dental Endocarditis y complicaciones de valvulopatías tras la extracción de un diente (si pasan a la sangre). Streptococcus neumoniae (neumococo): Diplococos No crecen en medios de bilis-esculina. Sáprofitos en la flora normal del aparato respiratorio. Patógenos en neumonías o en procesos piógenos e inflamatorios como meningitis, sinusitis, otitis, etc. Son patógenos si presentan cápsula con un polisacárido que facilita la invasión. También proteína M y polisacárido C se relacionan con la virulencia.

32 Identificación de Cocos G+

33 Aislamiento. Caracteres Bioquímicos
Toma de muestras: De rinofaringe con Hisopo estéril. Muestra del pus si hay. Frotis y tinción de gram de las muestras. + Tinción de cápsulas (tinción negativa)

34 Aislamiento. Caracteres Bioquímicos
Aislamiento por cultivo: 2 Tubos de agar sangre (uno aerobio y otro microaerofílico): Siembra por picadura (hemólisis en profundidad típica de S. pyogenes). Placa de agar sangre o chocolate: Agotamiento del asa. En Agar sangre de Carnero al 5%: Colonias grisáceas redondas bordes lisos.

35 Aislamiento. Caracteres Bioquímicos
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: Catalasa (–) Hemólisis en Agar sangre Sensibilidad a la optoquina (S. pneumoniae) Sensibilidad a la bacitracina (Gr. A: +). Hidrólisis del hipurato (Gr. A: +). Crecimiento en Bilis Esculina Crecimiento en medios al 6,5% de NaCl (D enterococo:+) Grupos antigénicos de Lancefield para los distintos tipos de sustancia C: Por métodos inmuológicos. Pruebas serológicas: Buscan anticuerpos en el suero del paciente: ASLO (Antiestreptolisina O) ASK (antiestreptoquinasas) ASH (antihialuronidasas) DNAasa, etc.

36 Identificación de Streptococcus por grupos
Hemólisis Inhibición bacitracina Inhibición optoquina Crec. En Bilis esculina HidrolisisHipurato sódico NaCl 6,5% Grupo Beta + (+) - A B +/- D (hemol. var) enterococo D (hemol. var) no enterococo C, G y F Alfa viridans S. pneumoniae

37 Neisseria Familia Neisseriaceae Gram – Diplococos Aerobios estrictos
Saprófitas o patógenas de la especie humana y animales. Oxidasa y catalasa positivos

38 Neisseria. Especies más importantes.
Neisseria meningitidis (meningococo) Producen meningitis Neisseria gonorrhoeae (gonococo) Producen gonorrea. Neisseria spp saprófitas. Habituales de rinofaringe y aparato genital, no patógenas. Las neiserias saprófitas son poco exigentes, fáciles de cultivar en medios comunes y crecen entre 22 y 35 ºC. N. meningitidis y N. gonorrhoeae son muy exigentes, dificiles de cultivar y solo crecen entre 35 y 37 ºC

39 Neisseria meningitidis: Acción patógena
Diplococos en granos de café Intra o extracelulares Afecta a vías respiratorias superiores y causa meningitis epidémica (sobre todo en niños con alta tasa de mortalidad). Factores de virulencia: La cápsula que le confiere gran resistencia Proteínas de membrana con acción muy tóxica. Fimbrias para adherirse al epitelio que invade La cápsula presenta un polisacárido con distintas propiedades antigénicas que permiten clasificar al menigococo en serogrupos (las cepas más patógenos pertenecen a los serogrupos A, B, y C). Los serogrupos más frecuentes en España son el B y el C

40 Neisseria meningitidis: Cuadro clínico
Comienza con rinofaringitis leve que evoluciona a más severa y posible bronquitis. Puede pasar a sangre y de allí a piel dando petequias, fiebres altas y artralgias. Puede pasar a líquido cefalorraquídeo y meninges (meningitis): Fiebres muy altas, cefaléa, rigidez de nuca, vómitos, diarreas, etc. que pueden acabar en muerte si no se trata rápidamente. El examen de líquido cefalorraquídeo es turbio, purulento y con abundantes meningococos.

41 Neisseria gonorrhoeae: Acción patógena
Diplococos con afinidad por las mucosas urogenitales. Intra y extracelualres Produce la Gonorrea de transmisión por contacto sexual. Factores de virulencia: Proteínas de membrana con diferentes características antigénicas. Fimbrias (adherencia y dificultad para ser fagocitadas) Endotoxina que inactiva anticuerpos próximos.

42 Neisseria gonorrhoeae: Acción patógena
Tras el contacto sexual: A las pocas horas los gonococos se adhieren a las mucosas mediante las fimbrias Penetran a tejidos subepiteliales, se multiplican y liberan endotoxinas con efecto sobre uretra, cuello uterino, ano, etc. con destrucción de células epiteliales, formación de procesos supurativos purulentos, dolor a la micción por uretritis, afectando también a cuello de útero y vaginitis en mujeres. Sobre el 50% son asintomáticos  cronificación (al no ser tratado).

43 Neisseria meningitidis. Aislamiento. Caracteres bioquímicos.
TOMA DE MUESTRAS: De LCR por punción lumbar Examinar rápidamente (sensible) A la muestra de LCR turbio y purulento (dos tubos) se le realiza: Tubo 1: Examen directo: Se centrifuga: Sedimento  Frotis para tinciones (gram, tinta china, etc.) Sobrenadante: Técnicas inmunológicas para detectar Polisacáridos capsulares y proteínas. Tubo 2: Siembra en Agar sangre, agar chocolate, etc. (en 5 – 10% CO2 + Humedad) Puede realizarse también un hemocultivo (3er tubo).

44 Neisseria meningitidis. Aislamiento. Caracteres bioquímicos.
Pruebas bioquímicas: Catalasa (+) Oxidasa (+) O/F con glucosa y maltosa (oxidativo) Reducción de NO3 a NO2 (-) Estudios serológicos del LCR o del Suero.

45 Neisseria gonorrhoeae. Aislamiento. Caracteres bioquímicos.
TOMA DE MUESTRA: En el laboratorio a primera hora antes de la primera micción (si es posible) De uretra, recto y cuello de útero. EXAMEN DIRECTO: Frotis y tinción de gram. CULTIVO: en medios enriquecidos (agar sangre, agar chocolate, Thayer Martin modificado, NYC medium) Incubar a 35 – 37 ºC, humedad al 70 % y 5 – 10 % de CO2. Pruebas bioquímicas: O/F, oxidasa, catalasa, etc. Pruebas serológicas (ELISA).

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