TECNICAS DEL DNA RECOMBINANTE

Presentación del tema: "TECNICAS DEL DNA RECOMBINANTE"— Transcripción de la presentación:

1 TECNICAS DEL DNA RECOMBINANTE
Dra. Eugenia Jedlicki C. noviembre 2007

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3 UN GEN (O UN FRAGMENTO CUALQUIERA DE
¿COMO SE PUEDE SEPARAR ESPECIFICAMENTE UN GEN (O UN FRAGMENTO CUALQUIERA DE DNA) A PARTIR DEL GENOMA COMPLETO DE UN ORGANISMO?

4 Número de bases Número de genes E.coli 4 x 10 3 Kb 4.000
GENOMAS Número de bases Número de genes E.coli 4 x Kb Ser Humano 3 x 10 6 Kb

5 CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION A UN VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN UN HOSPEDERO (OBJETIVO: PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

6 OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE
GENERACION DE FRAGMENTOS DE DNA A PARTIR DE DNA CROMOSOMAL OBTENCION DEL cDNA

7 ENZIMAS DE RESTRICCION
_ ENZIMAS BACTERIANAS (MECANISMO DE PROTECCION) _ ACTIVIDAD ENDONUCLEASICA: CORTAN ENLACE FOSFODIESTER INTERNO EN DNA DOBLE HEBRA _ RECONOCEN SECUENCIAS ESPECIFICAS (4, 6, 8 pb) _ DEJAN EXTREMOS COHESIVOS O ROMOS

8 Enzimas de Restricción

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10 Productos generados por enzimas de restricción
extremos cohesivos EcoRI 5’…GAATTC…3’ 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’ 3’…CTTAA G…5’ PstI 5’…CTGCAG…3’ 5’…CTGCA G…3’ 3’…GACGTC…5’ 3’…G ACGTC…5’ extremos romos HaeIII 5’…GGCC…3’ 5’…GG CC…3’ 3’…CCGG…5’ 3’…CC GG…5’

11 Electroforesis en geles
Aplicación de un campo eléctrico Separación através de la matriz del gel Visualización de los fragmentos de DNA Separa fragmentos de DNA por tamaño 8

12 Stained with ethidium bromide (EtBR) to Visualize the DNA
Agarose Gel Stained with ethidium bromide (EtBR) to Visualize the DNA 1000 bp 700 bp 600 bp 500 bp

13 CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS 1) OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION AL VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN UN HOSPEDERO (PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

14 Creación de moléculas de DNA Recombinante in vitro
5’ ...GAATTC... ...GAATTC ’ 3’ ...CTTAAG... ...CTTAAG ’ Eco RI Eco RI Separation of restriction fragments (P) -OH 5’ G 3’ CTTAA (P) -OH 5’ G 3’ CTTAA OH AATTC 3’ G 5’ anneal OH (P) AATTC 3’ G 5’ 5’ GAATTC 3’ CTTAAG DNA Ligase Recombinant DNA

15 FORMACION DNA RECOMBINANTE
RECOMBINACION DE FRAGMENTOS DE DNA EN UN GENOMA PEQUEÑO (VECTOR) 1.- VECTOR: VEHICULO EN EL CUAL DNA DE INTERES ES SELECTIVAMENTE AMPLIFICADO 2.- HOSPEDERO: ASEGURA MANTENCION Y AMPLIFICACION DE DNA RECOMBINANTE

16 insertado en un plasmidio
Fragmento de DNA libre Fragmento de DNA insertado en un plasmidio Cromosoma 1ª división celular 2ª división celular

17 CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE
CLONAMIENTO _ ORIGEN DE REPLICACION INDEPENDIENTE DEL DNA GENOMICO _ SITIOS UNICOS DE RESTRICCION _ MARCADORES DE SELECCION

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22 CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION AL VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION DEL VECTOR RECOMBINANTE EN UN HOSPEDERO (OBJETIVO: PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

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25 el concepto de “genoteca”
Una genoteca es una colección representativa de fragmentos de DNA de un organismo contenidos en clones individuales. Deben estar presente todos los fragmentos obtenidos de la digestión del DNA cromosomal Dos tipos de genotecas: - cDNA - DNA genómico

26 OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE
GENERACION DE FRAGMENTOS DE DNA A PARTIR DE DNA CROMOSOMAL OBTENCION DEL cDNA

27 cDNA library construction
5’ AAAAA 3’ mRNA (all mRNAs in cell) anneal oligo(dT) primers of bases in length 5’ AAAAA TTTTT 3’ 5’ 3’ add reverse transcriptase and dNTPs 5’ 3’ AAAAA TTTTT 3’ 5’ cDNA

28 Genoteca de cDNA Sólo secuencias codificantes
Secuencias de genes tejido específicos

29 CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION AL VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN UN HOSPEDERO (PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

30 RASTREO (SCREENING): DETECCION DEL CLON
QUE POSEE EL GEN DE INTERES METODO DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS METODO INMUNOQUIMICO

31 Hibridación Las hebras de DNA hibridan por complementaridad de bases
ETAPAS Desnaturar el DNA doble hebra por calor y dejar enfriar Hebras complementarias vuelven a aparearse Sonda: fragmento de DNA complementario a secuencia génica en estudio. Debe marcarse para su posterior detección 18

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33 Desnaturar Fijar a un soporte Hibridar con una sonda radiactiva P* P* Lavar P* P* P* P*

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36 RASTREO (SCREENING): DETECCION DEL CLON
QUE POSEE EL GEN DE INTERES METODO DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS METODO INMUNOQUIMICO

37 VECTOR DE EXPRESION

38 Vector de expresión en bacterias

39 Expresión de proteínas en bacterias
cDNA clonado Expresión de proteínas en bacterias Vector de expresión Inicio de la transcripción ATG cDNA Represor lac IPTG RNA Proteina

40 Antibody screening

41 DNA RECOMBINANTE EN MEDICINA
ANTICOAGULANTES FACTORES SANGUINEOS ERITROPOYETINA FACTORES DE CRECIMIENTO HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA INSULINA HUMANA INTERFERONES INTERLEUKINAS ANTICUERPOS MONOCLONALES VACUNAS

42 ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE
SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

43 TECNICA DE SOUTHERN

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46 ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE
SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

47 Técnica de Sanger para secuenciar el DNA:
el DNA se denatura: hebras simples el partidor se hibrida a la hebra molde el DNA es sintetizado usando DNA polimerasa 5’ 3’ 3’ |||||||||||||||

48 Polinucleotídicas crecen por Adición de nucleótidos al Extremo 3´ OH
FUNDAMENTO Las Cadenas Polinucleotídicas crecen por Adición de nucleótidos al Extremo 3´ OH

49 Dideoxy Sequencing Fred Sanger

50 Todos los posibles productos
ddATP DNA dNTPs ddTTP DNA dNTPs ddGTP DNA dNTPs ddCTP DNA dNTPs 5’ 3’ ||||||||||||||| A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C T A cada fragmento termina en ddA T A G T A Todos los posibles productos de la reacción conteniendo ddATP T A G T A C A T A G T A C A G T A T A G T A C A G T A G T T C A T A G T A C A G T A G T T C A G A

51 SECUENCIACION DEL DNA METODO ENZIMATICO

52 A T G C 5’ 3’ |||||||||||||||
A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C A T G C fragmentos largos TAGTACAGTAGTTCAGATCGTG fragmentos cortos

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54 migración graphics taken from Cold Spring Harbor Laboratory web site:
darwin.cshl.org/shockan.html

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56 ENSAMBLAR LAS SECUENCIAS:
lertsggrdxz cdfdwggzappu rdxzacdfdw dfjnmlerts

57 LAS SECUENCIAS ENSAMBLADAS
dfjnmlerts lertsggrdxz rdxzacdfdw cdfdwggzappu dfjnmlertsggrdxzacdfdwggzappu

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59 SORPRESA No.1 1 2 3 4 Tropinin T Smooth muscle Ejemplo de splicing
Tropinin T Ejemplo de splicing alternativo Smooth muscle Otros tejidos

60 Sólo 2% del genoma son genes.
SORPRESA No. 2 98% del genoma Gen 1 Gen 2 Sólo 2% del genoma son genes.

61 Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés.
SORPRESA No. 3 Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés.

62 Hay sólo 0,1% de variación genética entre todos los seres humanos.
SORPRESA No. 4 Hay sólo 0,1% de variación genética entre todos los seres humanos. Pero 0,1% de bases = bases

63 ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE
SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

64 ds DNA TECNICA DE PCR ETAPAS Etapa 1 Desnaturación Etapa 2
Alineamiento Etapa 3 Extensión 19

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67 Aplicaciones del PCR Clonamiento del DNA Mutagénesis In-vitro
Identificación de genes Medicina forense Detección de mutaciones (enfermedades genéticas) 22

68 ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE
SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

69 Célula normal Célula cancerosa mRNA Gen expresado sólo en la célula normal Gen expresado sólo en la célula cancerosa Gen expresado en ambas células Computador lo cambia a negro

70 Cy Cy5 Cy5/Cy log Cy5/Cy3

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72 Llevando la Medicina Correcta al Paciente Correcto
Pacientes que responden sin un serio efecto lateral Pacientes que responden pero que sufren un serio efecto lateral Diagnóstico Perfiles Medicina Correcta Paciente Correcto Llevando la Medicina Correcta al Paciente Correcto

73 el diseño de drogas personalizadas
Variaciones en los genes entre diferentes personas dan cuenta de diferentes respuestas a un mismo tratamiento terapéutico. Un nuevo concepto en la medicina: el diseño de drogas personalizadas Proteína X de persona A Proteína X de persona B

74 el diseño de drogas personalizadas
Variaciones en los genes entre diferentes personas dan cuenta de diferentes respuestas a un mismo tratamiento terapéutico. Un nuevo concepto en la medicina: el diseño de drogas personalizadas Proteína X de persona A Proteína X de persona B la droga no es funcional

75 el diseño de drogas personalizadas
Variaciones en los genes entre diferentes personas dan cuenta de diferentes respuestas a un mismo tratamiento terapéutico. Un nuevo concepto en la medicina: el diseño de drogas personalizadas Proteína X de persona A Proteína X de persona B Diseño de una droga específica